Mikrobiom

npj Biofilms and Microbiomes Band 8, Artikelnummer: 70 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Mikrobiome, insbesondere das Pansenmikrobiom, sind aufgrund ihrer Komplexität und Vielfalt vielfältig für die biotechnologische Nutzung geeignet. In dieser Studie wurden antimikrobielle Peptide (AMPs) aus dem Pansenmikrobiom (Lynronne 1, 2, 3 und P15s) auf ihr therapeutisches Potenzial gegen sieben klinische Stämme von Pseudomonas aeruginosa untersucht. Alle AMPs zeigten antimikrobielle Aktivität gegen alle Stämme, mit minimalen Hemmkonzentrationen (MICs) im Bereich von 4–512 µg/ml. Die Zeittötungskinetik aller AMPs bei 3-fachen MHK-Werten gegen die Stämme PAO1 und LES431 zeigte eine vollständige Abtötung innerhalb von 10 Minuten bis 4 Stunden, obwohl P15s keine bakterizide Wirkung gegen PAO1 hatte. Alle AMPs hemmten die Biofilmbildung durch die Stämme PAO1 und LES431 deutlich, und Tests zur Induktion von Resistenzen zeigten keinen Rückgang der Aktivität gegen diese Stämme. Die AMP-Zytotoxizität gegenüber menschlichen Lungenzellen war ebenfalls minimal. Was den Wirkungsmechanismus angeht, zeigten die AMPs eine Affinität zu den bakteriellen Membranlipiden PAO1 und LES431 und permeabilisierten die P. aeruginosa-Membran effizient. Die Transkriptom- und Metabolomanalyse ergab eine erhöhte katalytische Aktivität an der Zellmembran und eine Förderung der β-Oxidation von Fettsäuren. Schließlich zeigten Tests, die mit dem Galleria-mellonella-Infektionsmodell durchgeführt wurden, dass Lynronne 1 und 2 in vivo wirksam waren und eine Überlebensrate von 100 % nach der Behandlung mit 32 mg/kg bzw. 128 mg/kg aufwiesen. Diese Studie veranschaulicht das therapeutische Potenzial von Mikrobiom-abgeleiteten AMPs gegen P. aeruginosa-Infektionen.

Mikrobiome bieten aufgrund ihrer Komplexität und Vielfalt eine weitgehend ungenutzte Ressource an neuartigen Bioaktivstoffen für die biotechnologische Nutzung. Ein Paradebeispiel ist der Pansen, in dem Bakterien, Pilze, Protozoen und Phagen symbiotisch interagieren, um Energie aus aufgenommenem Futter zu gewinnen1. Allerdings zeigen Pansenmikroben, wie die meisten Mikrobiome, Konkurrenzverhalten, wenn die Bedingungen zum Überleben Widerstandsfähigkeit erfordern. Kürzlich wurde die Produktion neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe durch Pansenmikroben nachgewiesen, die möglicherweise die Wettbewerbsfähigkeit verbessern2,3,4,5,6. Viele dieser antimikrobiellen Mittel werden als antimikrobielle Peptide (AMPs) klassifiziert und haben sich auch als wirksam gegen eine Reihe pathogener Bakterien erwiesen, was ihre potenzielle medizinische Anwendung neben ihrer Rolle bei der Aufrechterhaltung der Funktion des Pansenmikrobioms verdeutlicht2,3. Tatsächlich wurden in einer Übersicht von O'Neill aus dem Jahr 2016 sechs mögliche Strategien beschrieben, die zur Behandlung multiresistenter bakterieller Infektionen, zu denen auch AMPs gehörten, erforscht werden müssen7.

AMPs sind normalerweise kationisch und stellen eine strukturell vielfältige Gruppe von Molekülen dar, die aus kurzen Peptidsequenzen bestehen, die gegen potenziell pathogene Bakterien wirksam sind und gleichzeitig in der Lage sind, angeborene Abwehrkräfte und den Entzündungsprozess zu modulieren8. Es gibt eine wachsende Zahl von AMPs mit einem breiten Spektrum an biologischer Aktivität, die vielversprechend für potenzielle biomedizinische Anwendungen sind, da sie entzündungsfördernde Reaktionen regulieren, die Zellproliferation stimulieren, die Wundheilung durch Modulation der Zellmigration fördern und vieles mehr können9. Ihre antimikrobiellen Mechanismen sind einzigartig und in Kombination mit herkömmlichen Antibiotika können kationische AMPs ihr Spektrum und ihre therapeutischen Wirkungen erweitern10. Kationische AMPs kommen natürlicherweise in einer Vielzahl von Organismen vor und stellen einen Hauptbestandteil des angeborenen Immunsystems dar.11 Sie werden ständig entdeckt und könnten bei strategischer Entwicklung die Behandlung arzneimittelresistenter Infektionen voranbringen.

Tatsächlich war die strategische Entwicklung neuartiger antimikrobieller Mittel noch nie so wichtig, da die Multiresistenz (MDR) zunimmt und folglich unsere Fähigkeit, bakterielle MDR-Infektionen zu behandeln, abnimmt. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) prognostiziert, dass es bis 2050 zu Todesfällen im Zusammenhang mit MDR-Bakterien kommen wird größer sein als die Zahl der krebsbedingten Todesfälle. Die WHO hat auch die ESKAPE-Krankheitserreger (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter-Arten) als besonders besorgniserregend identifiziert, da sie eine große MDR aufweisen und für die meisten nosokomialen und Wundinfektionen weltweit verantwortlich sind12. ESKAPE-Krankheitserreger verfügen über eine Reihe antimikrobieller Resistenzmechanismen, darunter enzymatische Inaktivierung, Biofilmbildung, Veränderung der Zellpermeabilität und Modifikation von Arzneimittelzielen13. Tatsächlich können mikrobielle Biofilme viele Antibiotikabehandlungen und Komponenten des Immunsystems des Wirts unwirksam machen14. Darüber hinaus wird die komplexe Biofilmbildung durch P. aeruginosa als Hauptursache für die verzögerte Wundheilung bei chronischen Wunden angesehen15 und seit über 40 Jahren gilt die chronische P. aeruginosa-Infektion bei Mukoviszidose-Patienten als biofilmorientierte Infektion14. Folglich stehen nur sehr wenige neuartige Antibiotika zur Behandlung von P. aeruginosa-Infektionen zur Verfügung, und die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung von Biofilminfektionen ist von größter Bedeutung, um die erheblichen Gesundheitskosten zu senken und die Morbidität der Patienten zu verringern16.

In dieser Studie haben wir die In-vitro- und In-vivo-Wirksamkeit von vier aus Pansenmikrobiomen stammenden AMPs Lynronne 1 (19 AAs: LPRRNRWSKIWKKVVTVFS-NH2), Lynronne 2 (20 AAs: HLRRINKLLTRIGLYRHAFG-NH2), Lynronne 3 (20 AAs: NRFTARFRRTPWRLCLQFRQ-) bestimmt. NH2) und P15s (20 AAs: KFVRLKIYCRDKNKGRGISF-NH2) gegen P. aeruginosa-Stämme unter Verwendung biochemischer und „omischer“ Technologien. Oyama et al. untersuchten das Pansenmetagenom mithilfe von funktionellem Screening und anderen rechnerischen Ansätzen, um potenzielle antimikrobielle Peptidkandidaten für therapeutische Anwendungen zu identifizieren2. In dieser Studie wurden Lynronne 1–3 und P15 charakterisiert und als wirksam gegen Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und andere klinisch relevante bakterielle Krankheitserreger, einschließlich P. aeruginosa-Stämme, befunden2. Die Aktivitäten von Lynronne 1–3 gegen Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) wurden umfassend charakterisiert, während in der Studie von Oyama et al.2 nur die antimikrobielle Empfindlichkeit von Krankheitserregern gegenüber P15 untersucht wurde.2 Die Strukturmodellierung zeigte, dass Lynronne 1–3 eine α-helikale Konformation amphipathischer Natur annimmt, mit einer positiven Nettoladung und einem Hydrophobizitätsverhältnis von ≥40 %2. In dieser Studie haben wir die 3D-Struktur von P15 charakterisiert. Wir untersuchten auch den Wirkungsmechanismus aller vier AMPs, Lynronne 1–3 und P15s, gegen klinische Stämme von P. aeruginosa. Einige präklinische Daten für die topische Anwendung von Lynronne 1–3 an einem Mausmodell einer MRSA-Wundinfektion liegen bereits vor, jedoch wurde hier die Wirksamkeit in einem PAO1-Galleria-mellonella-Infektionsmodell untersucht. Diese Studie liefert die grundlegenden präklinischen Daten, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit dieser AMPs als zukünftige alternative Therapeutika zu bestimmen.

In der Grundlagenstudie von Oyama et al.2 wurde eine große Anzahl neuer AMPs aus dem Pansenmetagenom identifiziert und charakterisiert. In dieser Studie wurde gezeigt, dass Lynronne 1, Lynronne 2 und Lynronne 3 gegen zahlreiche bakterielle Krankheitserreger wirksam sind, insbesondere gegen MRSA. Für diese Studie wird die Anfälligkeit multiresistenter klinischer Isolate von P. aeruginosa gegenüber Lynronne 1, 2, 3 und den weniger charakterisierten P15 als minimale Hemmkonzentration (MIC) und minimale bakterizide Konzentration (MBC) in Tabelle 1 dargestellt. Diese P. aeruginosa-Stämme wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen AMR-Profile und geografischen Standorte ausgewählt. Weitere Metadaten für die Stämme sind in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Peptide waren gegen die getesteten gramnegativen Stämme aktiv, wobei Lynronne 1 die höchste Aktivität und die niedrigste MHK aufwies über alle Stämme hinweg, im Bereich von 4 μg/ml für das Isolat C3719 bis 64 μg/ml für das Isolat AES-1R. Die MHK-Werte von Lynronne 2 lagen zwischen 8 und 64 μg/ml, während Lynronne 3 und P15 bei allen Isolaten mit MHK-Werten zwischen 32 und 256 bzw. 32 und 512 μg/ml am wenigsten aktiv waren. Der Stamm LES400 war am wenigsten anfällig für das Kontrollantibiotikum Levofloxacin (MHK = 1 μg/ml), war jedoch am anfälligsten für die AMPs, wobei alle vier AMPs eine MHK von 16 oder 32 μg/ml aufwiesen. Die Stämme AMT0060-2, AES-1R und NH57388A waren am wenigsten anfällig für die AMPs (MICs = 32–512 μg/ml).

Nachfolgende MBC-Werte wurden durch das Vorhandensein lebensfähiger Bakterien nach einer 24-stündigen Inkubation auf Müller-Hinton-Agar bestimmt (Tabelle 1). Die MBC-Bestimmung bestätigte, dass die Hemmung des bakteriellen Wachstums von AMPs einer bakteriziden Wirkung entspricht, und die MBC-Werte blieben bei der MHK oder maximal zweifach höher als die MHK.

Oyama et al.2 fanden heraus, dass Lynronne 1–3 eine positive Nettoladung von +6, +5 bzw. +6 mit einem Hydrophobieverhältnis von ≥40 % hatte, wohingegen P15s positiv geladen (+6) mit einem Hydrophobieverhältnis war von 35 % und ein Arginin-Lysin-Verhältnis (R + K) von 35 % (Abb. 1a). Es wurde gezeigt, dass Lynronne 1–3 α-helikale Konformationen annehmen2. Eine detailliertere Strukturanalyse von Lynronne 1, einschließlich Lösungs-NMR-Spektroskopie, bestätigte eine amphipathische Helix mit 13 Resten, die alle sechs kationischen Reste enthält, was positiv mit einer erhöhten Peptidselektivität verbunden ist17. Die Strukturmodellierung mit PEP-FOLD ergab eine antiparallele β-Faltblatt-Kurvenstruktur für P15s, die sich von den α-helikalen Konformationen unterscheidet, die Lynronne 1–3 angenommen hat (Abb. 1a).

a Vorhergesagte Struktur für Peptid 15s: Hauptkette und Seitenketten in Band- bzw. Stabdarstellung dargestellt und je nach Atomtyp gefärbt: Kohlenstoff, Sauerstoff und Stickstoff in Grün, Rot bzw. Blau. Mit PyMol gerenderte Abbildung. b Zeitabhängige Abtötung der P. aeruginosa-Stämme PAO1 und (c) LES431 durch die AMPs Lynronne 1, 2 und P15s bei 3-facher MHK-Konzentration. d AMP-Anti-Biofilm-Etablierungsaktivität und Wirksamkeit gegen 24 Stunden etablierte Biofilme des Pseudomonas-Stamms PAO1 und (e) LES431 mit Lynronne 1, Lynronne 2 und P15s, dargestellt als prozentuale Biofilmreduktion (OD570 nm) gegenüber unbehandelt (Wachstumskontrolle), Signifikanz berechnet unter Verwendung der Einfaktor-ANOVA. Für die Panels b–e stammen die Werte aus drei unabhängigen Replikaten und Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar (wenn sie nicht sichtbar sind, liegt dies an mangelnder Variabilität).

Wir fuhren fort, die bakterizide Aktivität von Lynronne 1, 2 und P15s gegen zwei Isolate, die P. aeruginosa-Stämme PAO1 und LES431 neben Levofloxacin und Polymyxin B, weiter zu charakterisieren. Diese beiden klinischen Stämme wurden aufgrund ihrer Häufigkeit der Erwähnung in der Literatur und ihrer unterschiedlichen MHK ausgewählt /MBC-Werte. Lynronne 3 wurde aufgrund der höheren MHK und MBCs nicht weiter charakterisiert. Abtötungskinetik-Assays wurden unter Verwendung der Zählung der koloniebildenden Einheiten (CFU) durchgeführt, nachdem die Bakterien dem 3-fachen MHK der AMPs in kationenangepasster Mueller-Hinton-Brühe ausgesetzt wurden. Die antimikrobiellen Konzentrationen für In-vitro-Time-Kill-Assays variieren in der Literatur. In dieser Studie wurde 3x MIC gewählt, um mit den zuvor veröffentlichten AMP-Daten übereinzustimmen2. Die Daten zeigten eine schnelle zeitabhängige Abtötung beider Stämme durch Lynronne 1 und 2 mit einer Reduktion von ≥3 log KBE/ml innerhalb der ersten 2 Stunden für PAO1 (Abb. 1b) und in der ersten Stunde (<10 Minuten Exposition) für LES431 (Abb. 1c). P15s hingegen zeigten während des Testzeitraums keine bakterizide Wirkung gegen PAO1, zeigten jedoch eine starke abtötende Wirkung (>8 Log KBE/ml Reduktion) gegen den Stamm LES431. Ähnliche Muster zeigten sich bei Lynronne 1 und 2, die im Vergleich zu LES431 eine relativ langsamere Reduzierung der KBE/ml gegenüber PAO1 zeigten. Levofloxacin hatte die erwartete bakterizide Wirkung sowohl gegen PAO1 als auch gegen LES431 mit einer Verringerung der Zellzahl um ≥3 log KBE/ml18. Im Vergleich zu Lynronne 1 und 2 dauerte es jedoch etwa dreimal länger, bis Levofloxacin eine ähnliche Reduzierung der KBE/ml zeigte. Polymyxin B zeigte eine Reduzierung um >8 Log KBE/ml gegenüber PAO1, war jedoch nicht in der Lage, den Log KBE/ml von LES431 innerhalb des Testzeitraums zu reduzieren.

Die Fähigkeit von Lynronne 1, 2 und P15, die Bildung von P. aeruginosa PAO1- und LES431-Biofilmen zu hemmen/verhindern, sowie ihre Aktivität gegen etablierte (24-Stunden-)Biofilme wurden untersucht. Für diesen Assay verwendeten wir ein 96-Well-Platten-Biofilmmodell2. Bei einer 3-fachen MHK-Konzentration waren die AMPs in der Lage, PAO1 (einfaktorielle ANOVA, P = 2,33E-26) (Abb. 1d) und LES431 (einfaktorielle ANOVA, P = 6,37E-24) (Abb. 1d) signifikant zu senken. 1e) Biofilmanhaftung. Bei einer 3-fachen MHK-Konzentration zeigten alle Peptide keine signifikante Anti-Biofilm-Aktivität gegen etablierte (24 h) Biofilme von P. aeruginosa PAO1 und LES431 (Abb. 1d, e).

Resistenzen gegen kationische AMPs sind ein aufkommendes Phänomen und beeinträchtigen ihre Wirksamkeit als potenzielle Therapeutika19. Um vielversprechende therapeutische AMP-Kandidaten zu identifizieren, müssen Resistenzmechanismen bewertet werden, um festzustellen, ob bestimmte Mutationen oder Resistenzgene bereits vom Zielpathogen erworben wurden20. Nach serieller Passage von Kulturen in Gegenwart von Sub-MIC-Konzentrationen von Lynronne 1, 2 und P15s über einen Zeitraum von 25 Tagen wurden keine resistenten Mutanten der P. aeruginosa-Stämme PAO1 und LES431 erhalten (alle MHK-Werte der seriellen Passage-Assays sind aufgeführt). in der Ergänzungstabelle 1). Diese Ergebnisse ergänzen die Erkenntnisse von Oyama et al., die keine Selektion resistenter Mutanten durch Lynronne-AMPs bei verschiedenen Krankheitserregern, einschließlich Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus (MRSA)2, zeigten.

In Oyama et al. wurde die Zytotoxizität von Lynronne 1–3 gegenüber HUVEC- und HepG2-Zellen von Säugetieren mit relativ geringer Zytotoxizität getestet2. In dieser Studie wurde die Zytotoxizität der AMPs gegenüber fibroblastischen (IMR90-Zellen) Lungenzellen (Abb. 2a) und menschlichen Epithelzellen (BEAS-2B) (Abb. 2b) bewertet, weiteren Zellen, die für potenzielle P. aeruginosa-Infektionsstellen repräsentativ sind. Bei Konzentrationen von bis zu 1 mg/ml blieben die mit P15s behandelten Zellen in beiden Zelllinien zu über 50 % lebensfähig. Die IC50-Werte (d. h. die Peptidkonzentration, die zu einer 50-prozentigen Abnahme führt) für die Lebensfähigkeit der Zellen für die AMPs Lynronne 1, 2 und P15s sind wie folgt (Tabelle 2); 138,9 ± 34,18, 1177 ± 309,2 und 3337 ± 882,3 µg/ml für BEAS-Zellen und 94,23 ± 21,74, 803,2 ± 202,8 bzw. 948,9 ± 224 µg/ml für IMR90-Zellen. Daher zeigten Zytotoxizitätsdaten, dass P15s im Vergleich zu Lynronne 1 und 2 am wenigsten zytotoxisch waren. Darüber hinaus war die Epithelzelllinie (BEAS-2B) im Vergleich zu den Fibroblastenzellen (IMR90) weniger anfällig für alle AMPs.

a Zytotoxizität von Lynronne 1, 2 und P15s gegenüber menschlichen Lungenzellen IMR90 (menschliche Bronchialfibroblasten). b Zytotoxizität von Lynronne 1, 2 und P15s gegenüber BEAS-2B (menschliche Lungenepithelzellen). In allen Fällen stammen die Werte aus drei unabhängigen Replikaten; Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. c AMP-Membranpermeabilisierungsaktivität bei 4× MIC gegen PAO1, gemessen mit der Propidiumiodid-Methode über die Zeit (d) AMP-Membranpermeabilisierungsaktivität bei 4× MIC gegen LES431, gemessen mit der Propidiumiodid-Methode über die Zeit. In beiden Fällen stammen die Werte aus drei unabhängigen Replikaten; Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt (falls nicht sichtbar, liegt dies an mangelnder Variabilität).

Zuvor wurde gezeigt, dass Lynronne 1 und 2 in der Lage sind, die Zellmembran von MRSA USA300 zu permeabilisieren2. In dieser Studie waren alle AMPs (Lynronne 1, 2 und P15s) bei 4-fachen MHK-Werten in der Lage, die Zellmembranen von PAO1 (Abb. 2c) und LES431 (Abb. 2d) innerhalb der ersten 20 Minuten der Exposition zu permeabilisieren, was auf eine Membranstörung hindeutet Wirkmechanismus. Lynronne 1 und 2 zeigten eine relativ schnellere Permeabilisierungsfähigkeit der Bakterienmembran mit einer Permeabilisierung von 49 % bis 82 % (PAO1) und 66 % bis 96 % (LES431) nach 5 Minuten. Im Gegensatz dazu wirken P15s, obwohl sie membranolytisch sind, mit nur 16 % (PAO1) Permeabilisierung nach 5 Minuten relativ langsamer und erreichen nach 40 Minuten Exposition eine maximale Wirkung, die der der anderen AMPs (81 % Permeabilisierung) entspricht.

Die Berechnung des Therapeutischen Index (TI) für jedes der aus dem Mikrobiom abgeleiteten Peptide (Tabelle 2) ergab, dass Lynronne 2 und P15 einen deutlich höheren TI (sowohl mittlerer TI als auch TI-Bereich) aufweisen als Lynronne 1, das den niedrigsten TI aufwies getestete AMPs, was darauf hindeutet, dass das Verhältnis von Zytotoxizität zu antimikrobieller Aktivität möglicherweise nicht optimal ist.

Mithilfe von TEM beobachteten wir Veränderungen in der Morphologie der PAO1-Bakterienzellen nach der Behandlung mit Lynronne 1 und P15s (Abb. 3). Aufgrund der ähnlichen hemmenden und bakteriziden Aktivität von Lynronne 1 und 2 wurden für diesen Test nur Lynronne 1 und P15 ausgewählt, da wir die Hypothese aufstellten, dass diese AMPs den qualitativ größten Unterschied im Wirkmechanismus aufweisen könnten. Nach einer einstündigen Behandlung mit Lynronne 1 war die Morphologie der PAO1-Zellen beeinträchtigt, und die mikroskopischen Aufnahmen zeigen eine mögliche Störung der Zellmembran mit Zytoplasmaleckage (Abb. 3b). Nach einer einstündigen Behandlung mit P15s (Abb. 3c) ist es im Vergleich zu unbehandelten Zellen schwieriger, morphologische Unterschiede zu erkennen, da die äußere Membran noch intakt ist (Abb. 3a), was auf einen möglichen Aktivitätskontrast zu Lynronne 1 hinweist Beispiele sind in der Ergänzung dargestellt (Ergänzung Abb. 7).

a Unbehandelte PAO1-Zellen (b) Mit Lynronne 1 behandelte (3× MIC für 1 h) PAO1-Zellen (c) P15s-behandelte (3× MIC für 1 h) PAO1-Zellen. Auf mikroskopischen Aufnahmen sind 500-nm-Maßstabsbalken dargestellt.

Die Wechselwirkung der AMPs mit Membranlipiden wurde durch Messung des kritischen Insertionsdrucks mithilfe eines Lipid-Monoschichtsystems (Langmuir-Balance)2 bewertet. Die Wechselwirkung von Peptiden mit Lipidextrakten der Ziel-P. aeruginosa-Stämme PAO1 und LES431 (Abb. 4a, c, e) wurde gemessen. Um zu bestimmen, ob die Peptide selektiv waren, wurden reine Lipide verwendet, wobei auch Lipide gemessen wurden, die auf dem äußeren Membranblatt der Bakterien oder auf eukaryotischen Membranen vorhanden waren, wie Phosphatidylglycerin (PG), Cardiolipin, Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE) (Abb . 4b, d, f).

Lipidmonoschichtmessungen für die Wechselwirkung von Lynronne 1, 2 und P15s mit Gesamtlipidextrakten oder reinen Lipiden, eine Wechselwirkung von Lynronne 1 mit LES431- und PA01-Lipidextrakten, b Wechselwirkung von Lynronne 1 mit reinen Lipiden, c Wechselwirkung von Lynronne 2 mit LES431 und PA01-Lipidextrakte, d Interaktion von Lynronne 2 mit reinen Lipiden, e Interaktion von P15s mit LES431 und PA01-Lipidextrakten, f Interaktion von P15s mit reinen Lipiden. PC 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin, PG 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), PE 1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamin, Cardio Cardiolipin.

Bei der Beurteilung der AMP-Lipid-Monoschicht-Wechselwirkungen mit PAO1 und LES431 war Lynronne 2 am wirksamsten und zeigte eine Affinität zu den bakteriellen Lipidextrakten. Trotz geringerer Zytotoxizität gegenüber den Säugetierzelllinien BEAS-2B und IMR90 zeigten P15s in AMP-Lipid-Monoschicht-Wechselwirkungsstudien eine Affinität zu PC (dem mittleren Lipid des äußeren Blättchens der menschlichen Zellmembran). Trotz der schnellen Abtötung von LES431 durch P15s, die in der Zeitabtötungskinetik nachgewiesen wurde, hatte das Peptid einen niedrigeren kritischen Insertionsdruck, wenn es mit reinen Lipidextrakten von LES431 getestet wurde. P15s zeigten einen höheren kritischen Insertionsdruck gegenüber reinen PAO1-Lipidextrakten, aber eine erheblich langsamere Verringerung der KBE/ml in der Time-Kill-Kinetik, was darauf hindeutet, dass der Wirkungsmechanismus gegen PAO1 und LES431 wahrscheinlich unterschiedlich ist.

Alle AMPs interagierten mit unterschiedlicher Selektivität mit den Lipiden (Tabelle 3). Lynronne 1 und P15s interagierten bevorzugt mit reinen Lipiden des äußeren Blättchens der Bakterienmembran, d. h. Cardiolipin, PG, und in geringerem Maße mit den reinen Lipiden des äußeren Blättchens der eukaryontischen Zellmembran, d. h. PC, PE, was zu ähnlichen Ergebnissen führte Affinität (Abb. 4b, f). Lynronne 2 interagierte auch mit PG, Cardiolipin und PE, wurde jedoch am stärksten in PC eingefügt (Abb. 4d). Stärkere Wechselwirkungen mit PC könnten auf mögliche hämolytische Eigenschaften von Lynronne 1 und 2 hinweisen, da dieses reine Lipid zur Nachahmung der Wechselwirkung mit der Zytoplasmamembran von Säugetierzellen verwendet wird21.

Beide P. aeruginosa-Stämme PAO1 und LES431 wurden einer Behandlung mit Lynronne 1, Lynronne 2 und P15s unterzogen, um die Wirkung der Peptide auf Transkriptomebene im Vergleich zu unbehandelten Zellen besser zu verstehen. Die Behandlung mit den AMPs bei MIC-Konzentration für 60 Minuten wurde gewählt, um eine ausreichende RNA-Ausbeute und -Qualität aus lebensfähigen Zellen sicherzustellen. Aus diesem Assay wurden 24 Proben sequenziert (drei Replikate für jede Behandlung und unbehandelt, für PAO1 und LES431, entnommen nach 1 Stunde), was im Durchschnitt etwa 26 Millionen Lesevorgänge für PAO1 und etwa 31 Millionen Lesevorgänge für LES431 (36,54 GB Daten zusammen) ergab Lesen Sie die Länge vor dem Trimmen von 126 für beide Stämme ab. Diese Sequenzen wurden dann den Referenzgenomen zugeordnet (NCBI: txid208964 für PAO1 und txid1408272 für LES431). An den ausgerichteten Messwerten wurden eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) und eine hierarchische Clusteranalyse (HCA) mit einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, um die Kontroll- und Behandlungseffekte auf PAO1 und LES431 zu zeigen (ergänzende Abbildung 1). Die Trennung zwischen behandelten Gruppen und Kontrollgruppen war für beide Stämme in den PCA-Diagrammen offensichtlich, wurde jedoch in den Abbildungen der partiellen kleinsten Quadrate-Diskriminanzanalyse noch deutlicher (Abb. 5a, b). Die Analyse der differentiellen Expression identifizierte die 20 differenziell exprimierten Gene (DEGs) mit der höchsten Variablen für jeden Stamm und wird in einer Heatmap zusammengefasst, die die am stärksten hoch- oder herunterregulierten Gene in allen Behandlungsgruppen zeigt, gekennzeichnet mit (NCBI)-Genbezeichnungen für PAO1 (Abb. 5a). Aufgrund der schlechten Charakterisierung von LES431 sind die 20 DEGs mit der höchsten Variablen mit Locus-Tags gekennzeichnet, die die Produktnamen der Proteine ​​der Pseudomonas-Genomdatenbank anzeigen, um die Interpretation zu erleichtern (Abb. 5b). Vergleiche zwischen einzelnen Peptidbehandlungen für beide Stämme werden in Vulkandiagrammen dargestellt (ergänzende Abbildung 2). Für PAO1 zeigte die GO-Anreicherungsanalyse der 20 wichtigsten variablen DEGs, dass 75 % der kartierten Gene mit der katalytischen Aktivität (GO:0003824) und 25 % der kartierten Gene mit der Transporteraktivität (GO:0005215) assoziiert waren (ergänzende Abb . 3). Die GO-Anreicherungsanalyse der 40 wichtigsten variablen Gene (ergänzende Abbildung 6) zeigte eine signifikant verringerte Expression von arcA, arcB und arcC in Gegenwart von Lynronne 1 und Lynronne 2, Arc-Operon-Genen, die mit dem Argininstoffwechsel und dem Arginin-Deiminase-Weg (ADI) assoziiert sind. 22. Eine Störung des Argininstoffwechsels lässt darauf schließen, dass Lynronne 1 und 2 die Schutzkapazität von PAO1 zur Anpassung des zytoplasmatischen pH-Werts als Reaktion auf feindselige extrazelluläre Veränderungen des Säuregehalts verringert haben. Bei P15 war der Argininstoffwechsel weniger stark beeinträchtigt, allerdings war die Expression des Arginin-Ornithin-Antiporters (arcD), der für den Transportaustausch von Ornithin und Arginin an der Bakterienmembran verantwortlich ist, deutlich herunterreguliert. Die AMPs beeinflussten auch Gene, die mit der PAO1-Atmungskette assoziiert sind, erheblich. cbb3-Oxidasen ermöglichen P. aeruginosa das Wachstum in sauerstoffarmen Umgebungen (z. B. Biofilmen) und werden in P. aeruginosa unter anoxischen Bedingungen stärker exprimiert23. Daher könnte eine verringerte Expression der cbb3-Oxidasen ccoN2 und ccoP2 in Gegenwart der AMPs ein Hinweis auf eine verringerte Aggregation und eine mögliche Anti-Biofilm-Peptidaktivität sein. Es wurde gezeigt, dass NO-Reduktase pathogene Bakterien vor NO schützt, einem toxischen freien Radikal, das von Wirtsmakrophagen produziert wird24. Eine erhöhte Expression der NO-Reduktase-Untereinheiten norB und norC durch PAO1 in Gegenwart von Lynronne 1, 2 und P15s weist auf eine mögliche Atemhemmung und Stressreaktion auf die Anreicherung von NO hin.

Partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA) und hierarchische Clusteranalyse (HCA): Heatmap basierend auf den 20 Top-Variablen-Genen, die Unterschiede zwischen unbehandelten und den Peptiden Lynronne 1, Lynronne 2 und P15s-Probengruppen für den P. aeruginosa-Stamm hervorhebt ( a) PAO1 und (b) LES431.

Die Metabolitenprofile von PAO1 und LES431 wurden nach einstündiger Behandlung bei MIC-Konzentration mit Lynronne 1, Lynronne 2, P15s und unbehandelten Kontrollgruppen erhalten. Aus der überwachten Hauptkomponentenanalyse (PLS-DA) konnten unterschiedliche Cluster für die verschiedenen antimikrobiellen Behandlungen sowohl für PAO1 als auch für LES431 erkannt werden (Abb. 6a, b). Dies deutet darauf hin, dass die Peptide möglicherweise auf einzigartige Stoffwechselwege abzielen. Die hierarchische Clusteranalyse nach einer einfaktoriellen ANOVA zeigt die am signifikantesten exprimierten Metaboliten in den Behandlungs- und Kontrollgruppen (Abb. 6a, b). Bei LES431 scheinen die Peptidgruppen stärker geclustert zu sein, und es ist eine klarere Unterscheidung zwischen den Peptid- und Kontrollgruppen zu erkennen. Für LES431 wird eine univariate Analyse einzelner Metaboliten mit den signifikantesten Unterschieden zwischen der Behandlungs- und der Kontrollgruppe gezeigt (Abb. 7). Die Diagramme verdeutlichen signifikante Unterschiede in der Metabolitenexpression, hauptsächlich für Phosphatidylethanolamine und Glycerin, zwischen den Peptidbehandlungsgruppen. Bei PAO1 war es schwieriger, signifikante Metabolitunterschiede zwischen den Behandlungsgruppen zu unterscheiden. Ornithin gilt jedoch als einer der am stärksten exprimierten Metaboliten in PAO1, einem entscheidenden Bestandteil des Argininstoffwechsels, und wird über den ADI-Weg22 aus der Zelle transportiert. Dies unterstreicht einen möglichen Zusammenhang zwischen den Omic-Datensätzen, da in der RNA-seq-Analyse gezeigt wurde, dass Gene für Arc-Operons, die am ADI-Signalweg beteiligt sind, von den AMPs beeinflusst werden. Nach einer Auswertung der Metabolomikdaten für PAO1 und LES431 zusammen ist es offensichtlich, dass sich beide Stämme metabolomisch unterscheiden und daher unabhängig voneinander betrachtet werden müssen (ergänzende Abbildung 4).

PLS-DA und hierarchische Clusteranalyse (HCA): Heatmap für die Elektrospray-Massenspektrometrie mit negativer Ionisationsflussinjektion (FIE-MS), generiert auf der Grundlage der 25 wichtigsten Metaboliten durch Einweg-ANOVAs für die Peptidmetabolitengruppen (Lynronne 1, Lynronne 2). und P15s) und die unbehandelte (a) PAO1- und (b) LES431-Metabolitengruppe. Im FIE-MS-negativen Ionisationsmodus identifizierte Metaboliten.

Boxplots einzelner Metaboliten (a–c) Phosphatidylethanolamine, (d) Diglycerid und (e) Glycerin, die relative Konzentrationsunterschiede zwischen der unbehandelten Gruppe und der Peptidgruppe zeigen. Linie durch die Box: Median, Quadrat: Mittelwert, Box: 25. und 75. Perzentil, Whiskers: 5. und 95. Perzentil (univariater t-Test, P < 0,05).

Lynronne 1, Lynronne 2 und P15 zeigten bei keiner der getesteten Konzentrationen nach 96-stündiger Inokulation in G. mellonella toxische Wirkungen (ergänzende Abbildung 5). Die PAO1-Infektionsdosis (LD50) wurde mit ~1,15 × 102 KBE/Larve bestimmt, während die tödliche Dosis (LD) mit ~1,17 × 104 KBE/Larve bestimmt wurde (verursachte Melanisierung und Tod aller Larven vor 24 Stunden). Die Wirkung der Peptide beim Schutz der Larven vor einer PAO1-Infektion wurde dann unter Verwendung von ~1,17 × 104 oder ~1,32 × 103 KBE/Larven-PAO1 bewertet. Für die mit 104 Zellen infizierte Larvengruppe; die Sterblichkeitsrate lag nach 24 Stunden bei 100 % (Abb. 8a). Mit 103 Zellen infizierte Larven hatten nach 24 Stunden eine Überlebensrate von 50 %, starben jedoch nach 48 Stunden zu 100 % (Abb. 8b). Infizierte Larven, die mit Lynronne 1 (32 mg/kg) oder Lynronne 2 (128 mg/kg) behandelt wurden, zeigten nach 24 Stunden ein 100 %iges Überleben bei einer Infektionsdichte von 103 und 104 KBE/Larve. Die Behandlung mit P15s bei 128 mg/kg verhinderte nicht den Tod der Larven nach einer Infektion mit 104 KBE/Larve, die Behandlung mit P15s bei 384 mg/kg führte jedoch zu einer Überlebensrate von 60 % nach 24 Stunden und 10 % nach 48 Stunden ( Abb. 8a). Nach der Infektion mit 103 KBE/Larve stieg die Überlebensrate bei einer P15s-Behandlung mit 384 mg/kg im Vergleich zu unbehandelten infizierten Larven signifikant an (paarweiser Vergleich, P = 0,00467). Zur statistischen Analyse wurde ein einfacher paarweiser Vergleich durchgeführt, um die Wirkung eines AMP zwischen antimikrobiellen Dosierungen und der Kontrollgruppe zu vergleichen. Das Mischen von Bakterien und spezifiziertem AMP vor der Injektion wurde auf weniger als eine Minute beschränkt und hatte daher keinen Einfluss auf die Signifikanz, da Daten zur Zeittötungskinetik für alle AMPs eine vollständige Abtötung von PAO1 nach >50 Minuten zeigten. Bei den mit PBS inokulierten Larven wurde weder Melanisierung noch Tod beobachtet. Darüber hinaus zeigten mit Lynronne 1 und Lynronne 2 behandelte Larven nach 96 Stunden keine Melanisierung (Abb. 8c). Auf den Tod der mit P15s behandelten Larven folgte während der Auswertungstage eine Melanisierung (Abb. 8c).

a Kaplan-Meier-Überlebenskurven von G. mellonella, infiziert mit 104 KBE/Larve. b Kaplan-Meier-Überlebenskurven von G. mellonella, infiziert mit 103 KBE/Larven von P. aeruginosa PAO1. c Repräsentative Bilder, die die Melanisierung von Larven zeigen, die 96 Stunden lang mit den Peptiden behandelt wurden.

Es wurde gezeigt, dass antimikrobielle Peptide aus dem Pansenmikrobiom gegen ein breites Spektrum von Organismen wirksam sind2. Die Auswertung der antimikrobiellen In-vitro- und In-vivo-Aktivität in dieser Studie ergab, dass diese AMP-Kandidaten wirksam gegen klinisch isolierte Stämme von P. aeruginosa waren und weiteres Potenzial als therapeutische Moleküle zeigten.

Die in dieser Studie ermittelten MHK- und MBC-Werte stimmen mit denen anderer AMPs gegen P. aeruginosa25 überein und sind sogar besser, im Vergleich zu herkömmlichen Antibiotika wie Levofloxacin und Polymyxin B jedoch aufgrund der unterschiedlichen Wirkungsweisen bescheiden. Eine geringere Peptidanfälligkeit, die bei Stämmen wie dem Australian Epidemic Strain (AES-1R) auftritt, könnte auf einen höheren Anteil an mit der Außenmembran assoziierten Genen und einen geringeren Anteil an zytoplasmatischen Genen zurückzuführen sein26. Im Vergleich zu anderen Stämmen wie C3719 könnte eine höhere Porinaktivität von AES-1R für den erhöhten MHK-Wert verantwortlich sein.

In dieser Studie wird deutlich, dass die β-Faltblatt-Peptid-P15s anders wirken als die α-helikalen Lynronne-1- und Lynronne-2-Peptide, und die Ursache dieser Wirksamkeitsunterschiede ist wahrscheinlich auf ihre strukturelle Übernahme zurückzuführen. Trotz ähnlicher antimikrobieller Aktivitätspotenziale ist bekannt, dass kationische AMPs, die α-helikale oder amphipathische β-Faltblattstrukturen annehmen, sich in ihrer Fähigkeit, Zellmembranen zu binden und zu zerstören, stark unterscheiden können, wobei sich β-Faltblattkonformationen oft als weniger lytisch erweisen27. Wie bereits von Oyama et al. festgestellt, weisen Lynronne 1 und Lynronne 2 eine positive Nettoladung (+6 und +5) mit einem Hydrophobieverhältnis (≥40 %) auf, das größer ist als bei P15 (35 %)2. Geringfügige Unterschiede in der Peptidhydrophobie und Ladungsverteilung können einen erheblichen Einfluss auf die Durchdringung und Zerstörung der Bakterienmembranen haben und das Ausmaß der Schädigung der Membranen von Wirtssäugetieren bestimmen28.

Lynronne 1 und Lynronne 2 zeigten eine schnelle bakterizide Abtötung von P. aeruginosa PAO1- und LES431-Isolaten mit einer Reduktion um ≥3 log KBE/ml innerhalb der ersten 60 bzw. 10 Minuten der Behandlung. P15s zeigten eine ähnliche bakterizide Aktivität auf LES431-Kulturen, jedoch nicht auf PAO1-Kulturen. Diese Daten legen nahe, dass P15s möglicherweise einen alternativen Wirkmechanismus zu Lynronne 1 und Lynronne 2 nutzen. Wir spekulieren auch, dass der Unterschied in der Aktivität der AMPs zwischen PAO1 und LES431 auf ihre unterschiedlichen Lipopolysaccharid (LPS)-Expressionsprofile zurückzuführen sein könnte. Eine verringerte AMP-Wirksamkeit gegen PAO1 ist zu erwarten, da LES431 nachweislich eine schwächere Motilität, Schwarm- und Biofilmbildungsfähigkeit aufweist29. Dies kann wiederum zu einer geringeren bakteriziden Wirkung gegen Stämme mit höherer Wachstumsdichte wie PAO1 führen. Die Referenzverbindungen Levofloxacin und Polymyxin B zeigten im Vergleich zu PAO1 eine geringere bakterizide Abtötung gegen LES431. Gegen weniger anfällige Stämme wie PAO1 müssen Lynronne 1, 2 und P15 möglicherweise nicht monotherapeutisch verabreicht werden und könnten in Kombination mit anderen herkömmlichen Verbindungen eingesetzt werden, um synergistische Effekte zu erzielen25.

Einmal etabliert, ist P. aeruginosa bekanntermaßen schwer zu behandeln. Unter anderem kann P. aeruginosa innerhalb eines Biofilms schnell wachsen und die Wirksamkeit der Wirtsabwehr oder der antimikrobiellen Behandlung verringern30. Diese Biofilme stellen in der Klinik ein großes Problem dar und treten häufig bei anfälligen Wirten mit Verbrennungen oder chronischen Wunden, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), Mukoviszidose, implantierten Biomaterialien und Wasservorräten auf31. Die AMPs waren in der Lage, die Bildung von Biofilmen in beiden Stämmen PAO1 und LES431 zu verhindern, waren jedoch nicht in der Lage, zuvor gebildete Biofilme signifikant zu entfernen. Daher wäre ein schnelles Vorgehen gegen die maximale Anzahl von Bakterienzellen, bevor sie in den Biofilm-Phänotyp eindringen und sich in diesen entwickeln, optimaler32. AMPs mit Eigenschaften zur Hemmung der Biofilmbildung sollten nicht übersehen werden und könnten einzigartige Anwendungen haben, beispielsweise bei der Prävention von Harnkatheter-assoziierten Infektionen durch die Verwendung einer antimikrobiellen Peptidbeschichtung33,34. Alternativ könnte die Kombination dieser antimikrobiellen Peptide mit herkömmlichen Antibiotika, von denen bekannt ist, dass sie auf bestimmte physiologische Subpopulationen von P. aeruginosa abzielen, auch die Biofilmausrottung verbessern35. Darüber hinaus kann es sein, dass eine Kombination von Lynronne 1, Lynronne 2 oder P15 zusammen mit der physikalischen Behandlung von Biofilmen, wie z. B. einer photodynamischen Inaktivierung, die Ablösung von Biofilmen induzieren und somit die antimikrobielle Wirksamkeit gegen vorab gebildete Biofilme erhöhen könnte16,36.

Wichtig ist, dass serielle Mutagenesetests keine resistenten Mutanten gegen die in dieser Studie getesteten aus dem Pansenmikrobiom stammenden AMPs ergaben. Die schnell wirkende Natur der Verbindungen verringerte wahrscheinlich das Resistenzbildungspotenzial von PAO1 und LES431, selbst bei subletalen Konzentrationen. Das Fehlen resistenter Mutanten deutet darauf hin, dass Lynronne 1, Lynronne 2 und P15 möglicherweise mehrere zelluläre Ziele haben, und unterstreicht ihre Aussicht auf potenzielle therapeutische Wirkstoffe. In der Literatur wurde die Resistenz gegen kationische AMPs als ein aufkommendes Hindernis erwähnt, das die Wirksamkeit von AMPs beeinträchtigt19. Allerdings ist die Resistenz gegen AMP-ähnliche Verbindungen oft das Ergebnis eines selektiven Drucks und nicht des Erwerbs spezieller Resistenzgene durch horizontalen Gentransfer20. Daher ist nach wiederholter Exposition gegenüber AMP-basierten Arzneimitteln mit einem allmählichen Anstieg der Resistenz oder einem „MIC-Creep“ zu rechnen. Darüber hinaus haben pharmakodynamische Studien gezeigt, dass in vivo die Wahrscheinlichkeit einer Resistenzentwicklung bei AMPs im Vergleich zu herkömmlichen Antibiotika geringer ist37.

Aufgrund der klinischen Probenherkunft und der Prämisse dieser AMPs kann P. aeruginosa bei Patienten mit Mukoviszidose schwere Lungeninfektionen verursachen. Daher war es angebracht, die Zytotoxizität der Peptide in menschlichen Lungenzellen zu testen. Trotz höherer Aktivität gegen PAO1 und LES431 in Empfindlichkeitstests scheint Lynronne 1 in niedrigeren Konzentrationen (~200 µg/ml) für die menschlichen Lungenzelllinien IMR90 und BEAS-2B zytotoxisch zu sein. Alternative Wirkmechanismen und Unterschiede in der Hydrophobie könnten die höhere Toxizität von Lynronne 1 und 2 für menschliche Zellen erklären. Es wurde gezeigt, dass die Hydrophobie und Ladungsverteilung von Peptiden eine Schlüsselrolle bei der Penetration und Zerstörung von Lipidmembranen spielen und daher die Toxizität kationischer antimikrobieller Peptide für Säugetierzellen bestimmen28. Um die Wirksamkeit zu verbessern, könnte die Stabilität von Lynronne 1 durch Syntheseverbesserungen verbessert werden. Es wurde gezeigt, dass eine teilweise Modifikation eines AMP, wie z. B. die D-Aminosäure-Substitution, die Zytotoxizität verringert38. P15s erwies sich sowohl für IMR90 als auch für BEAS-2B als am wenigsten zytotoxisch, was darauf hindeutet, dass die Verbindung in höheren Konzentrationen eingesetzt werden könnte. Wieder einmal weisen P15s im Vergleich zu Lynronne 1 und Lynronne 2 einzigartige Eigenschaften auf und liefern Belege für einen bestimmten Wirkmechanismus sowie ein Modell zur weiteren Untersuchung etwaiger mechanistischer Unterschiede.

Aufgrund ihrer angeborenen zellulären Selektivität ist die Aufrechterhaltung eines ausreichend großen therapeutischen Index (TI) für AMPs gegenüber Nicht-Zielwirtszellen eine Herausforderung39. Obwohl die Zellmembranzusammensetzung von Ziel- und Nichtzielzellen unterschiedlich ist, üben sowohl natürliche als auch synthetische AMPs häufig unerwünschte Kollateraltoxizität auf Säugetierzellen aus40,41. Lynronne 1 wies den niedrigsten TI der getesteten AMPs auf, was darauf hindeutet, dass die Zytotoxizität des Peptids gegenüber BEAS-2B- und IMR90-Zellen die Vorteile einer erhöhten antimikrobiellen Aktivität gegenüber PAO1 und LES431 überwiegen könnte. Der höhere TI für Lynronne 2 und P15 im Vergleich zu Lynronne 1 weist darauf hin, dass Lynronne 2 und P15 ohne Modifikation hinsichtlich der Toxizität die sichersten Kandidaten für die Entwicklung in therapeutischen Anwendungen wären.

Die Verwendung von TEM zur Beobachtung von Veränderungen der Integrität der Bakterienmembran kann eine wichtige Rolle bei der Aufklärung der Zelltodmechanismen bei tödlichen AMP-Konzentrationen spielen42. In dieser Studie lieferte TEM eine visuelle Bestätigung der vorgeschlagenen Unterschiede im Wirkmechanismus zwischen Lynronne 1 und P15. Die Zellmorphologie der mit Lynronne 1 behandelten PAO1-Zellen zeigte im Vergleich zu P15 eine erhebliche Störung der Zellintegrität, was den Wirkmechanismus der Zellstörung bestätigt.

Transkriptomik und Metabolomik wurden verwendet, um den Wirkungsmechanismus von Lynronne 1, 2 und P15s gegen die Stämme PAO1 und LES43 nach einstündiger Exposition weiter zu untersuchen. Es muss beachtet werden, dass der Rückschluss auf den Wirkmechanismus aus der Omic-Analyse komplex ist und dass P. aeruginosa in Gegenwart von antimikrobiellen Mitteln, die nicht mit dem Wirkmechanismus in Zusammenhang stehen, mehrere unabhängige Expressionsänderungen aufweisen kann. Die Annotation des PAO1-Transkriptoms ergab, dass die variabelsten Gene wahrscheinlich mit Stressreaktionen, einschließlich katalytischer Aktivität und Transmembranaktivitäten, verbunden sind. Wie bei anderen bekannten kationischen antimikrobiellen Peptidbehandlungen ist die Zerstörung der bakteriellen Zellmembran ein häufiger Wirkmechanismus2,42. Eine weitere Analyse signifikanter Genexpressionen mithilfe der GO-Anreicherungsanalyse ergab Informationen über die Wirkung des Peptids auf die molekulare Funktion. Pathogene Bakterien haben unterschiedliche Strategien entwickelt, um Arginin und den ADI-Weg zur Selbsterhaltung anzugreifen22. Der Argininstoffwechsel über den ADI-Weg ermöglicht es Mikroorganismen, sich an die Abwehrkräfte des Wirts und feindliche Umweltnischen anzupassen43. Der ADI-Weg erfordert mehrere Enzyme, die von Arc-Operon-Genen kodiert werden, einschließlich arcA, arcB und arcC, die Arginin zu Ornithin hydrolysieren und Nebenprodukte von ATP, CO2 und Ammoniak produzieren22,43,44. Die Produktion von Ammoniak und ATP schützt die Bakterien, indem sie die Aufrechterhaltung der zytoplasmatischen pH-Homöostase ermöglicht44. Es hat sich gezeigt, dass die Arginin-Stoffwechselfunktionen und der ADI-Signalweg für das Überleben von Bakterien unter sich ändernden Umweltbedingungen von entscheidender Bedeutung sind44 und eine signifikante Störung dieses Signalwegs durch Lynronne 1 und Lynronne 2 würde wahrscheinlich die adaptive Stressreaktion von PAO1 hemmen. Der ADI-Weg ist auf den Transport von Arginin in die Zelle und Ornithin aus der Zelle angewiesen und wird durch den Arginin-Ornithin-Antiporter (arcD) an der bakteriellen Zellmembran reguliert22. Aus den Anreicherungsdaten geht hervor, dass sich das Vorhandensein von P15 möglicherweise von Lynronne 1 und 2 unterscheidet, da es die Expression von arcA, arcB und arcC nicht so stark verringert. Es scheint jedoch einen indirekteren Einfluss auf den Argininstoffwechsel zu haben, indem es die Expression von arcD deutlich reduziert. P. aeruginosa verfügt über fünf terminale Oxidasen, darunter zwei Cytochrom-C-Oxidasen vom Typ cbb3, die für die aerobe Atmung essentiell sind, und nutzt diese Oxidasen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen über Isoformenkombinationen von CcoN-, CcoO- und CcoP-Untereinheiten45. Die transkriptomische Untersuchung ergab eine signifikant höhere Expression von Genen wie ccoN2 und ccoP2, die mit der Atmungskette in unbehandeltem PAO1 assoziiert sind, im Vergleich zu allen Peptidbehandlungen, insbesondere mit P15s. Eine verringerte Expression von ccoN2 und ccoP2 könnte auf eine Störung der antimikrobiellen Peptidmembran von PAO1 und die Aufrechterhaltung des elektrochemischen Potenzials und der ATP-Produktion durch den Organismus zurückzuführen sein, da diese Gene innerhalb der Zytoplasmamembran und der äußeren Membranvesikel lokalisiert sind. Eine Herunterregulierung von Genen, die mit der Atmungskette verbunden sind, könnte auch ein Zeichen für eine verminderte Anpassungsfähigkeit unter sauerstoffarmen Bedingungen wie Biofilmen sein45. Alternative Atmungsketten-assoziierte Gene, norB und norC, kodieren Cytochrom-Untereinheiten der NO-Reduktase, und dieses aktive Enzym katalysiert die Reduktion von NO zu N2046. NO-Reduktase fungiert als Atmungsenzym, das anaerobe Energie konserviert und exogenes NO46 entgiftet. Es wurde gezeigt, dass P. aeruginosa, denen die NO-Reduktase fehlt, eine verringerte Überlebensrate gegenüber nitrosativen Angriffen durch das Immunsystem des Wirts aufweist24,46. Die erhöhte Expression von NO-Reduktase, insbesondere bei P15s, aber auch bei Lynronne 1 und Lynronne 2, lässt darauf schließen, dass es in Gegenwart der AMPs zu einer erhöhten Akkumulation des toxischen NO-Zwischenprodukts innerhalb von PAO1 kommen könnte. Darüber hinaus könnte die Herunterregulierung der norB- und norC-Gene ein weiterer Hinweis auf eine Membraninteraktion sein, da diese Gene innerhalb der Zytoplasmamembran lokalisiert sind. Wie erwartet wurden viele der für LES431 hervorgehobenen Top-Variablen-Gene noch nicht charakterisiert und es lagen keine Informationen zu ihrer Funktion vor. Aus der transkriptomischen Analyse von PAO1 und früheren bakteriziden Tests gehen wir nach einer Stunde Behandlung mit den Peptiden davon aus, dass wahrscheinlich bereits ein erheblicher Tod eingetreten ist. Daher wird erwartet, dass Gene, die mit Stressreaktionen und membranassoziierten Signalwegen assoziiert sind, sowohl in PAO1 als auch in LES431 betroffen sein werden.

G. mellonella wurde für die In-vivo-Bewertung der Wirksamkeit verwendet, da es als geeignetes Modellsystem zur Identifizierung der Virulenzfaktoren von P. aeruginosa bei Säugetieren gilt47 und Einblicke in die Pharmakokinetik und therapeutische Wirkung antimikrobieller Mittel liefern kann48. Aus den Daten dieser Studie geht hervor, dass Lynronne 1 und Lynronne 2 in vivo wirksam gegen PAO1 waren und eine Überlebensrate der Larven von 100 % aufwiesen. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung der Larven mit P15s in einer Menge von 128 mg/kg, obwohl sie sich in früheren Tests als viel weniger zytotoxisch erwies, sowohl zu einer visuellen Melanisierung als auch zum Tod innerhalb von 24 Stunden. Dies kann auf die relativ langsamere Abtötung von P15s zurückzuführen sein, wie in den Time-Kill-Assays beobachtet, was es PAO1 ermöglicht, ungehemmte Bakterienaggregate zu bilden, deren Wachstum schwieriger zu verhindern ist. Dennoch ist es wichtig anzumerken, dass das Überleben von G. mellonella verbessert wurde, wenn es mit P15s in höheren Konzentrationen (384 mg/kg) behandelt wurde.

Aufgrund ihrer nachgewiesenen Wirksamkeit bei der primären In-vivo-Bewertung ist es möglich, dass Lynronne 1 teilweise modifiziert wird, um seine Zytotoxizität zu verringern. Auch Lynronne 2 und P15 konnten teilweise modifiziert und in deutlich höheren Konzentrationen als Lynronne 1 ohne zytotoxische Wirkungen eingesetzt werden. Zusammenfassend liefert diese Studie die grundlegenden präklinischen Daten, die erforderlich sind, um die Lebensfähigkeit dieser AMPs als zukünftige alternative Therapeutika, insbesondere zur Behandlung von P. aeruginosa-Infektionen, zu bestimmen.

Die 3D-Konformationsmodellierung des Peptids 15 S wurde mit der De-novo-Strukturvorhersagemethode PEP-FOLD49 durchgeführt. Zur Visualisierung der Ergebnisse wurde das Softwareprogramm PyMOL v1.7.6 verwendet (Schrödinger, LLC (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.7.6, 2010).

Die MHK-Werte wurden mithilfe einer modifizierten Mikroverdünnungsmethode50 in kationenangepasster Mueller-Hinton-Bouillon (MHB) (kationenangepasst), Tryptic-Soy-Bouillon (TSB) und Brain-Heart-Infusion-Bouillon (BHI) gemäß dem Standard 20776-1 der International Organization for Standardization bestimmt für MHK-Tests mit einer endgültigen bakteriellen Inokulumkonzentration von 5 × 105 KBE/ml51. Peptide und Vergleichsantibiotika wurden in sterilem destilliertem Wasser gelöst und in den gewünschten Konzentrationen zu sterilen 96-Well-Mikrotiterplatten aus Polypropylen mit U-Boden gegeben. Die MHK wurde als die niedrigste Konzentration an Peptid oder Antibiotikum definiert, die erforderlich ist, um das sichtbare Wachstum von Bakterien nach 18–24 Stunden Inkubation bei 37 °C zu hemmen. Unmittelbar anschließend wurde eine minimale bakterizide Konzentration (MBC) bestimmt. Von jeder einzelnen MIC-Plattenvertiefung wurden Teilproben genommen und 5 μl auf MH-Agar (oder alternative Medien, abhängig von den für die tatsächliche MIC verwendeten Medien) ausplattiert und dann über Nacht bei 37 °C inkubiert. Jedes sichtbare Koloniewachstum wurde am folgenden Tag aufgezeichnet, um den MBC-Wert zu bestimmen, dh dort, wo kein Wachstum zu sehen war.

Es wurde eine Bewertung der Abtötungszeiten von Peptiden und des Vergleichsantibiotikums (Levofloxacin) gegen die P. aeruginosa-Stämme PAO1 und LES431 durchgeführt52. Exponentialphasenkulturen von PAO1 und LES431 wurden in MHB (1 × 108–10 KBE/ml) gezüchtet und mit Peptiden (Lynronne 1, 2, 3 und P15s) in Konzentrationen behandelt, die das Dreifache ihrer MHK-Werte betrugen. Die Proben wurden seriell in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt und auf MHA plattiert. Nach einer Inkubation bei 37 °C für 18 bis 24 Stunden wurde die Anzahl der Kolonien aufgezeichnet2,52. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die KBE/ml wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inkubation über Nacht berechnet.

Um die Wirksamkeit der Peptide Lynronne 1, 2, 3 und P15s bei der Verhinderung und Zerstörung bereits gebildeter Biofilme zu bewerten, wurde eine 96-Well-Plattenmethode angewendet2. Um die Anhaftung von Biofilmen zu verhindern, wurden über Nacht Kulturen von P. aeruginosa PAO1 und LES431 gezüchtet und in MHB resuspendiert. Den resuspendierten Kulturen wurden einzeln Peptide mit einer 3-fachen MHK hinzugefügt, diese dann in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen gegeben und für weitere 24 Stunden in einen statischen Inkubator bei 37 °C gestellt. Nach der Inkubation wurden die Planktonzellen mithilfe von mindestens drei PBS-Waschschritten aus den Biofilmen gewaschen. Biofilme wurden 20 Minuten lang mit Methanol fixiert, 20 Minuten lang mit 0,4 % (Gew./Vol.) Kristallviolettlösung angefärbt und mit 33 % (V/V) Essigsäure wieder aufgelöst. Ein Mikroplatten-Spektrophotometer wurde verwendet, um die wieder aufgelösten Biofilme bei 570 nm zu messen. Aufgrund der Unterschiede in der anfänglichen OD für Biofilm-Replikate wurde die Biofilmaktivität als Prozentsatz der Verringerung der OD bei 5700 nm aufgetragen. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer Einzelfaktor-ANOVA berechnet.

Um die Zerstörung bereits gebildeter Biofilme zu messen, wurde der Assay um eine zusätzliche Inkubation erweitert. Übernachtkulturen von P. aeruginosa PAO1 und LES431 wurden verdünnt und ohne Behandlung auf Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen gegeben und 24 Stunden lang in einen statischen Inkubator bei 37 °C gestellt. Planktonzellen wurden durch drei PBS-Waschvorgänge entfernt und anschließend wurde frisches MH mit antimikrobiellen Verbindungen bei 3× MIC hinzugefügt. Anschließend erfolgte eine weitere 24-stündige statische Inkubation bei 37 °C. Planktonzellen wurden erneut mit PBS-Waschmitteln entfernt und die Schritte zur Biofilmfixierung, Färbung, erneuten Auflösung und Ablesung der optischen Dichte blieben gleich.

Kulturen der P. aeruginosa-Stämme PAO1 und LES431 wurden über einen Zeitraum von 25 Tagen kontinuierlich Lynronne 1, 2, 3 und P15s ausgesetzt, um potenzielle AMP-Resistenz aufzudecken. Wie im obigen MIC-Protokoll beschrieben, wurde für die erste Passage ein Mikroverdünnungs-Empfindlichkeitstest in Brühe unter Verwendung der Standard-Verdoppelungs-Verdünnungsreihe unter Verwendung kationenangepasster Muller-Hinton-Lösungen durchgeführt. Die MHK wurde nach 24-stündiger Inkubation der Kulturen bestimmt. Wells, die die höchste Konzentration an AMPs enthielten, die das Wachstum ermöglichten, wurden dann 1:1000 in MHB verdünnt und als Inokulum für den anschließenden MIC-Assay verwendet. Dieser Vorgang wurde über 25 Tage wiederholt.

Die zytotoxische Aktivität der aus dem Pansen stammenden Peptide gegen BEAS-2B (ATCC CRL-9609) und IMR90-Zellen (ATCC CCL-186) wurde bestimmt. BEAS-2B- und IMR90-Zelllinien wurden in Dulbeccos modifiziertem essentiellen Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), 1 % L-Glutamin und 1 % Antibiotika (alle Invitrogen), kultiviert. Die Zellen wurden routinemäßig auf 25-cm2-Kolben gezüchtet, die in einem 5 % CO2-Inkubator bei 37 °C gehalten wurden. Auf 25-cm2-Kolben gezüchtete Zellen wurden mit Trypsin-EDTA-Lösung (Thermofisher) abgelöst und in Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen (Greiner Bio-one) mit ~104 Zellen pro Vertiefung (gezählt unter Verwendung der Malassez-Kammer) ausgesät und bei 37 °C inkubiert C, 5 % CO2-Inkubator bis zur Konfluenz (~48–72 Stunden nach der Aussaat). Anschließend wurden die Vertiefungen abgesaugt und steigende Konzentrationen an Peptiden zu den Zellen gegeben, gefolgt von einer 48-stündigen Inkubation bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator. Anschließend wurden die Vertiefungen abgesaugt und die Lebensfähigkeit der Zellen mithilfe eines auf Resazurin basierenden In-vitro-Toxizitätstestkits (Sigma-Aldrich) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Resazurin-Stammlösung wurde im Verhältnis 1:100 in sterilem PBS mit Kalzium und Magnesium (PBS++, pH 7,4) verdünnt und die geleerten Vertiefungen wurden mit 100 μl der verdünnten Resazurin-Lösung gefüllt. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37 °C wurde die Fluoreszenzintensität mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen (Anregungswellenlänge 530 nm/Emissionswellenlänge 590 nm). Die Fluoreszenzwerte wurden von den Kontrollen normalisiert und als Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit ausgedrückt. Die IC50-Werte (d. h. die Konzentration der Peptide, die eine Verringerung der Zelllebensfähigkeit um 50 % verursacht) wurden mit der Software GraphPad® Prism 7 berechnet. Für die Kurve wurde ein nichtlinearer Regressionsparameter verwendet, der als Dosisreaktion voreingestellt war, um die Hemmung gegenüber der normalisierten Reaktion zu bestimmen.

Der AMP Therapeutic Index (TI) wurde berechnet, indem die IC50-Werte für jede Zelllinie (BEAS-2B oder IMR90) durch den angegebenen MIC-Wert für jeden Organismus (PAO1 oder LES431) dividiert wurden. Standardfehlerwerte (+/-) folgen dem TI, und MIC-Werte wurden als Referenz in Klammern gesetzt.

Die Auswirkungen von Lynronne 1 und P15s auf die Morphologie der PAO1-Bakterienzellen wurden mithilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Bakterienkulturen in der mittleren Log-Phase wurden unabhängig voneinander mit Lynronne 1 und P15s behandelt (bei 3 × MIC für 1 Stunde) und dann mit 2,5 % (v/v) Glutaraldehyd fixiert. Die Zellen wurden mit 1 % Osmiumtetroxid (Gew./Vol.) nachfixiert, mit 2 % (Gew./Vol.) Uranylacetat und Reynolds Bleicitrat angefärbt und unter Verwendung eines JEOL JEM1010 Transmissionselektronenmikroskops (JEOL Ltd., Tokio, Japan) bei 80 °C beurteilt kV. Die TEM wurde von Alan Cookson vom IBERS Aberystwyth University Advanced Microscopy and Bio-Imaging Laboratory durchgeführt.

Propidiumiodid-Assays wurden verwendet, um die Membranpermeabilisierung unter Verwendung von CTAB (300 µM) als Kontrolle zu beurteilen. Die Peptid-Lipid-Wechselwirkung wurde unter Verwendung einer wiederhergestellten Lipid-Monoschicht (Langmuir-Balance) gemessen. Mithilfe der Folch-Extraktion wurden vollständige Lipidextrakte aus Übernachtkulturen von P. aeruginosa-Stämmen erhalten, dann in Chloroform resuspendiert und unter Stickstoffbedingungen bei –20 °C gelagert. Reine bakterielle und eukaryotische Lipide, PE, PG, PC, Cardiolipin, LTA und LPS (Avanti Polar Lipid, USA) wurden ebenfalls in Chloroform (1 mg/ml) resuspendiert und unter den gleichen Bedingungen gelagert. Phosphatidylglycerin (PG), Cardiolipin, Phosphatidylglycerin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE). Phosphatidylglycerin (PG) und Cardiolipin stellen Lipide dar, die auf der Oberfläche der Bakterienmembran reichlich vorhanden sind. Phosphatidylglycerin (PC) stellt das Hauptlipid auf der Oberfläche eukaryontischer Membranen dar, während Phosphatidylethanolamin (PE) sowohl im inneren als auch im äußeren Membranblatt von Bakterien- und Eukaryontenmembranen vorkommt. Die Wechselwirkung der Peptide mit Pseudomonas-Gesamtlipidextrakten oder reinen Lipiden wurde durch Messung ihres kritischen Insertionsdrucks bewertet53. Der kritische Insertionsdruck wurde durch Ändern des Anfangsdrucks der Lipidmonoschicht (von 10 und 30 mN/m) und Messen der durch die Injektion des Peptids verursachten Druckschwankung (bei einer Endkonzentration von 1 µg/ml) bestimmt. Kurz gesagt wurden Lipide hinzugefügt, bis der gewünschte anfängliche Oberflächendruck erreicht war. Nach einer Inkubationszeit von 5–10 Minuten, die erforderlich war, um das Lösungsmittel zu verdampfen und den anfänglichen Oberflächendruck zu stabilisieren, wurden die Peptide mit einer 10-µl-Hamilton-Spritze subphasig in das PBS (pH 7,4, Volumen 800 µl) injiziert. Schwankungen des Oberflächendrucks, die durch die Insertion des Peptids in die Lipidmonoschicht verursacht wurden, wurden kontinuierlich mit einem vollautomatischen Mikrotensiometer (µTROUGH SX, Kibron Inc., Helsinki, Finnland) gemessen, bis das Gleichgewicht erreicht war (in den meisten Fällen etwa 20 Minuten, um den maximalen Oberflächendruck zu erreichen). Alle Experimente wurden in einer kontrollierten Atmosphäre bei 20 °C ± 1 °C durchgeführt und die Daten wurden mit dem Programm Filmware 2.5 (Kibron Inc., Helsinki, Finnland) analysiert. Die Variation des Oberflächendrucks wurde als Funktion des anfänglichen Oberflächendrucks aufgetragen und der kritische Insertionsdruck wurde als theoretischer Wert des anfänglichen Drucks der Lipidmonoschicht berechnet, der die Peptidinsertion nicht zulässt, d. h. eine Druckvariation gleich 0 mN/m. Die Genauigkeit des Systems wurde unter unseren Versuchsbedingungen für Oberflächendruckmessungen mit ±0,25 mN/m ermittelt.

Lynronne 1, Lynronne 2 und P15 gegen LES431 und PAO1 wurden durch transkriptomische Analyse nach vorab festgelegten Methoden untersucht54. Über Nacht wurden Bakterienkulturen in MHB unter Verwendung einer direkten Koloniesuspensionsmethode inokuliert und bei 37 °C (200 U/min) inkubiert, um eine mittlere logarithmische Wachstumsphase zu erreichen (ca. OD600 0,35–0,5). Anschließend wurde ein Aliquot von 2 × 106 KBE/ml aus der Kultur entnommen und in MHB verdünnt. Die kultivierten Stämme wurden dann mit Lynronne 1, Lynronne 2 und P15s in ihrer jeweiligen MHK-Konzentration (n = 3) behandelt. Die Behandlungszeit wurde auf 1 Stunde begrenzt, um die RNA-Qualität und -Ausbeute aufrechtzuerhalten; Alle unbehandelten Kulturen dienten als Kontrolle.

Nach der Behandlung wurden alle Suspensionen zweimal gewaschen und in einer Mischung aus PBS und RNAprotect Bacteria-Reagenz (QIAGEN, Hilden, Deutschland) (1:2) resuspendiert. Diese Suspension wurde sofort gevortext und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (20 °C ± 1 °C) inkubiert, bevor sie 10 Minuten lang bei 5000 × g zentrifugiert wurde. Zu dem gebildeten Pellet wurden Proteinase K (QIAGEN) und ein Bakterienlyse-Mix (QIAGEN), bestehend aus Mutanolysin und Lysozym, hinzugefügt. Anschließend konnte Tris-EDTA-Puffer hinzugefügt, verwirbelt und weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden. Anschließend wurde ein RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) verwendet, um den RNA-Extraktionsprozess an den behandelten Zellen gemäß den Richtlinien des Herstellers durchzuführen. Zur Quantifizierung der Gesamt-RNA-Proben wurde ein Qubit™-Fluorometer mit einem Breitband-RNA-Kit (Invitrogen, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem MICROBExpressTM-Kit (Thermo Fisher) gemäß den Richtlinien des Herstellers einer ribosomalen RNA-Depletion unterzogen. Anschließend wurden 400 ng angereicherte mRNA verwendet, um doppelt indizierte Sequenzierungsbibliotheken mit dem Illumina® TruSeq® Stranded-mRNA-Probenvorbereitungskit gemäß dem Illumina-Protokoll vorzubereiten (der Schritt der Poly-A-Anreicherung wurde weggelassen). Die Bibliotheken wurden dann vor dem Pooling mit dem Plattenspektrophotometer EpochTM (BIOTEK) quantifiziert und der endgültige Bibliothekspool über QubitTM quantifiziert. Die Größe der Amplikons wurde mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt, dann wurde der Bibliothekspool basierend auf der DNA-Konzentration und der durchschnittlichen Amplikongröße auf 10 nM verdünnt. Dieser Stammpool wurde dann zur Sequenzierung im 2 × 125-bp-Format auf einer Illumina HiSeq 2500-Plattform auf 8 pM verdünnt.

Die bakterielle Inkubation blieb mit allen vorherigen Tests konsistent (200 U/min bei 37 °C über Nacht). Für jedes Isolat wurden sechs biologische Replikate einzeln mit dem relevanten Peptid behandelt, mit Ausnahme der Kontrollgruppe, die unbehandelt blieb. Nach der anschließenden Inkubation wurden alle Proben während der mittleren exponentiellen Wachstumsphase gesammelt. Zu vorgegebenen Zeitpunkten wurde ein Aliquot der Bakterienkultur entnommen; 1 Stunde nach der Behandlung mit einer Testverbindung. Flüssiges N2 wurde verwendet, um die Proben schnell einzufrieren und so den weiteren Zellstoffwechsel zu stoppen. Diese Proben wurden dann bei –80 °C gelagert, bis alle Probenahmen abgeschlossen waren.

Die Extraktion von Metaboliten aus den Proben erfolgte mit einer von Baptista et al.55 entwickelten Methode. Nach dem Auftauen wurden alle Proben bei 10 °C und 1800 × g zentrifugiert. Anschließend wurden die Proben einzeln mit einer Kochsalzlösung (0,85 % NaCl) gewaschen und erneut unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet noch einmal in einer Salzlösung resuspendiert. Alle Proben wurden vor der Zugabe von 200 μl Extraktionspuffer, Chloroform/Methanol/Wasser (1:3:1)-Lösung, auf eine OD600 von 1 eingestellt. Um eine ausreichende Extraktion zu erreichen, wurden vier schnelle Gefrier-Tau-Zyklen mit flüssigem Stickstoff und periodischem Vortexen verwendet. Anschließend wurden alle Proben ein letztes Mal zentrifugiert (10 °C, 1800 × g) und in neue Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Fünfzig Mikroliter dieser endgültigen Mischung wurden in ein HPLC-Fläschchen überführt, das einen 0,2-ml-Mikroeinsatz mit flachem Boden enthielt, der für die Analyse mittels Flussinfusions-Elektrospray-Ionen-Hochauflösungsmassenspektrometrie (FIE-HRMS) erforderlich ist.

Das Metaboliten-Fingerprinting mittels hochauflösender Fließinjektions-Elektrospray-Massenspektrometrie (FIE-HRMS) wurde mit einem Exactive HCD-Massenanalysator durchgeführt. Das System ist mit einem Accela UHPLC-System (Thermo-Scientific) ausgestattet, das in einem einzigen Lauf Metaboliten-Fingerabdrücke sowohl im positiven als auch im negativen Ionisationsmodus erzeugen kann. Die Proben wurden in einen 100 µl/min-Fluss aus Methanol und Wasser (70:30) injiziert. Ionenintensitäten wurden mit einem m/z zwischen 50 und 1000 für 3,5 Minuten bei einer Auflösung von 100.000 (m/z 200) und einer ppm-Massengenauigkeit von 3 (±1) aufgezeichnet.

RNA-Sequenzen als „Fastq“-Dateien, die aus dem Miseq/Hiseq exportiert wurden, wurden dann mit Trimmomatic (v0.38)56 und FastQC/MultiQC (v0.11.9/v1.11) entsprechend gepaart, zugeschnitten und qualitätsgeprüft. Für beide Stämme wurden alle Illumina-spezifischen Sequenzen und Adapterregionen geschnitten (insgesamt 119 Basen). Kallisto (v. Kallisto 0.44.0)57 wurde als Kartierungstool für die Referenzgenome verwendet, und eine Analyse der differentiellen Expression wurde mit DESEQ258 ohne Schwellenwert (5573 PAO1 und 5965 LES431 differentiell exprimierte Gene) durchgeführt. Numerische Daten wurden aus dem Lesezählprogramm exportiert und zur statistischen Analyse in R eingegeben. Die Online-Ressource Geneontology.org wurde verwendet, um die Genbezeichnungen für die in DESEQ2 identifizierten signifikanten Gene zu bestimmen, Padj von <= 0,05 und eine logarithmische Änderung von >=2 wurde verwendet, um die Vulkandiagramme zu erstellen, ShinyGO 0,76 wurde für die GO-Anreicherungsanalyse verwendet Figuren.

Für die Metabolomik wurden die Empfehlungen des Herstellers verwendet, um die ESI-Quellenparameter festzulegen, und alle Rohdateien wurden in CDF-Dateien konvertiert, um in MATLAB (V8.2.0, The Math Works) massenausgerichtet und zentriert zu werden, um die höchste Massengenauigkeit zu gewährleisten. Für jeden Ionenmodus wurden die Massenspektren um die Spitze des Infusionspeaks in einer einzigen Intensitätsmatrix (Läufe × m/z) zusammengefasst. Vor der weiteren statistischen Analyse wurden alle Daten aus der Intensitätsmatrix logarithmisch transformiert. Die wichtigste statistische Analyseplattform zur Generierung von PCA- und Heatmap-Zahlen für den Metabolomics-Datensatz war MetaboAnalyst 4.059. Diese Software unterstützte auch die integrative Analyse zwischen den Transkriptom- und Metabolomics-Datensätzen.

G. mellonella-Larven wurden im Labor unter den beschriebenen Ernährungs-, Handhabungs- und Kultivierungsbedingungen kultiviert und gehalten60. Bei den verwendeten Larven handelt es sich um eine klonale Kultur mehrerer Generationen, die im Labor gehalten wird. Zehn (10) Larven mit einem mittleren Gewicht von jeweils 275 mg wurden zufällig ausgewählt, um sowohl die Zytotoxizität als auch die Wirksamkeit im Duplikat (biologische Replikate) zu testen. Larven mit vorheriger Melanisierung der Kutikula wurden in den Versuchen nicht verwendet. Für Zytotoxizitätstests wurden die Peptide Lynronne 1, Lynronne 2 und P15s in der MHK-Konzentration, nämlich 32 mg/kg Körpergewicht der Larve (LBW) für Lynronne 1 und 128 mg/kg LBW für Lynronne 2 und P15s, in das letzte Glied der Larven injiziert ; und 3× MIC, nämlich 96 mg/kg LBW für Lynronne 1 und 384 mg/kg LBW Lynronne 2 und P15s, wie im MIC-Assay bestimmt. Die Larven wurden im Dunkeln bei 37 °C gehalten. Die phänotypischen Überlebensaspekte wie Aktivität, Melanisierung, Kokonproduktion (Ausmaß der Seidenproduktion) und Überleben wurden 96 Stunden lang alle 24 Stunden überwacht. Die Kontrollgruppe bestand aus Larven, denen Wasser (Peptidtoxizitätstests) oder PBS (Bestimmung der tödlichen Dosis 50 – LD50 und der tödlichen Dosis – LD) injiziert wurde.

Zur Bestimmung der LD50 und LD von P. aeruginosa PAO1 in G. mellonella wurde den Larven ein Inokulum von 10 μl in PBS 1× (101 bis 105 KBE/Larve) injiziert. KBE > 104 töteten alle Larven innerhalb von 24 Stunden nach der Inokulation ab. Nach den Injektionen wurden die Larven im Dunkeln bei 37 °C gehalten. LD50 und LD wurden durch lineare Regression bestimmt. Zur Bewertung der Wirksamkeit von Peptiden bei G. mellonella, die mit P. aeruginosa infiziert waren, wurden 104 und 103 KBE/Larven verwendet. Das Bakterieninokulum und die Peptidlösungen wurden gemischt und sofort in die Larven eingeimpft (<1 Minute). Mit PBS und Bakterien injizierte Larven wurden als negative bzw. positive Kontrollen verwendet. Die Larven wurden im Dunkeln bei 37 °C gehalten und ihr Überleben wurde wie oben überwacht und analysiert. Zur Darstellung der Überlebenskurven wurde die Kaplan-Meier-Methode verwendet. Überlebensunterschiede wurden mithilfe des Log-Rank-Tests mit der Software R, Version 2.13.0, berechnet.

Die im Rahmen der Studie generierten und analysierten transkriptomischen Datensätze sind unter der Studiennummer PRJEB49970 im European Nucleotide Archive verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Dieses Projekt war durch die von KESS finanzierte Infrastruktur am IBERS der Aberystwyth University (UK) möglich. 3D-Strukturmodellierungsbilder wurden von Dr. Narcis Fernandez-Fuentes zur Verfügung gestellt. Wir möchten außerdem dem RCUK Newton Institutional Fund (172629373) und dem BBSRC UK (BB/L026716/1) danken.

IBERS, Aberystwyth University, Aberystwyth, SY23 3DA, Wales, Großbritannien

Adam J. Mulkern, Alan R. Cookson, Toby J. Wilkinson und Luis AJ Mur

TWINCORE, Zentrum für experimentelle und klinische Infektionsforschung, ein Joint Venture zwischen der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) und dem Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung (HZI), Hannover, Deutschland

Adam J. Mulkern und Bamu F. Damaris

Institut für globale Ernährungssicherheit, 19 Chlorine Gardens, Queen's University of Belfast, Belfast, Nordirland, BT9 5DP, Vereinigtes Königreich

Linda B. Oyama, Christopher J. Creevey und Sharon A. Huws

Das Roslin Institute und R(D)SVS, University of Edinburgh, Easter Bush, Roslin, Edinburgh, EH25 9RG, Großbritannien

Toby J. Wilkinson

Aix Marseille Univ, CNRS, Centrale Marseille, iSm2, 13397, Marseille, Frankreich

Hamza Olleik & Marc Maresca

Labor für Molekulargenetik von Bakterien, Abteilung für Mikrobiologie, Institut für Biotechnologie in der Landwirtschaft, Bundesuniversität Viçosa, Viçosa, Brasilien

Giarla C. da Silva, Patricia P. Fontes und Denise MS Bazzolli

Abteilung für Mikrobiologie, Bundesuniversität Viçosa, Viçosa, 36570-900, Brasilien

Hilario C. Mantovani

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LO, SH und CC haben das Projekt konzipiert. AM schloss mit Hilfe von LO, TW, die Laborarbeiten unter der Aufsicht von SHAC ab und unterstützte AM bei der Transmissionselektronenmikroskopie. AM, HO und MM führten die Membranpermeabilisierungs-, Zytotoxizitäts- und Lipidinteraktionstests durch. CC und BD halfen AM bei der RNA-Seq-Datenanalyse. LM half AM bei der Analyse von Metabolomics-Datensätzen. GS und PF haben die In-vivo-Arbeit an G. mellonella unter Aufsicht von DB, HM, LO abgeschlossen und SHAM hat die Arbeit mit Beiträgen aller Co-Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Adam J. Mulkern oder Sharon A. Huws.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mulkern, AJ, Oyama, LB, Cookson, AR et al. Aus Mikrobiomen gewonnene antimikrobielle Peptide bieten therapeutische Lösungen für die Behandlung von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen. npj Biofilms Microbiomes 8, 70 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00332-w

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Eingegangen: 07. Februar 2022

Angenommen: 05. August 2022

Veröffentlicht: 29. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-022-00332-w

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npj Biofilme und Mikrobiome (2022)