Veränderung der intrazellulären Proteinexpression als Schlüsselmechanismus für die durch Kupferoxid-Nanopartikel verursachte Verschlechterung der bakteriellen Denitrifikation

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 15824 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Die zunehmende Produktion und Nutzung von Kupferoxid-Nanopartikeln (CuO-NPs) führt zu Freisetzungen in die Umwelt. Der Einfluss von CuO-NPs auf die bakterielle Denitrifikation, einen der wichtigsten Wege zur Umwandlung von Nitrat in Distickstoff in der Umwelt, wurde jedoch selten untersucht. Hier berichteten wir, dass CuO-NPs eine signifikante Veränderung der Schlüsselproteinexpression eines Modelldenitrifizierers, Paracoccus denitrificans, verursachten, was zu einer starken Hemmung der Denitrifikation führte. Die Gesamteffizienz der Stickstoffentfernung sank von 98,3 % auf 62,1 %, während die CuO-NPs von 0,05 auf 0,25 mg/L anstiegen. Zellmorphologie- und Integritätsstudien zeigten, dass Nanopartikel in die Zellen gelangten. Die proteomische Bioinformatikanalyse zeigte, dass CuO-NPs die Regulierung von Proteinen bewirken, die am Stickstoffstoffwechsel, Elektronentransfer und Substanztransport beteiligt sind. Die Herunterregulierung des GtsB-Proteins (verantwortlich für den Glukosetransport) verringerte die Produktion von NADH (Elektronendonor für die Denitrifikation). Außerdem wurde die Expression wichtiger Elektronentransferproteine (einschließlich NADH-Dehydrogenase und Cytochrom) durch CuO-NPs unterdrückt, was sich negativ auf den Elektronentransfer zur Denitrifikation auswirkte. Weitere Untersuchungen ergaben, dass CuO-NPs die Expression und katalytischen Aktivitäten von Nitratreduktase und Nitritreduktase signifikant hemmten. Diese Ergebnisse lieferten ein grundlegendes Verständnis der negativen Einflüsse von CuO-NPs auf die bakterielle Denitrifikation.

Der Stickstoffkreislauf, einer der wichtigsten biogeochemischen Kreisläufe in der Biosphäre, führt die Umwandlung von Stickstoff in verschiedene Formen in der Atmosphäre, im Wasser, auf dem Land und in Organismen durch. Der Denitrifikationsprozess, der Nitrat in Distickstoff umwandelt und das Stickstoffelement in die Atmosphäre zurückführt, ist von großer Bedeutung für den engen Zusammenhang mit dem globalen Klimawandel, der Wasserqualität und der Gesundheit des Ökosystems1. Denitrifizierende Bakterien sind die am weitesten verbreiteten Denitrifizierer und erreichen die Nitratreduzierung über eine Reihe biologischer Prozesse. Die denitrifizierenden Stoffwechselreaktionen werden letztlich durch verschiedene funktionelle Proteine gesteuert, wie zum Beispiel Elektronentransferproteine und denitrifizierende Enzyme. Es wurde berichtet, dass die Expression dieser Proteine den zellulären Metabolismus von Denitrifikatoren bestimmt2,3.

Mit der rasanten Entwicklung der Nanotechnologie wurden technisch hergestellte Nanomaterialien in verschiedenen Bereichen wie der Biomedizin, der Materialsynthese und der chemischen Katalyse in großem Umfang eingesetzt4,5. Es wurde berichtet, dass Nanomaterialien negative Auswirkungen auf menschliche Zellen6,7,8, Pflanzen9 und Modellbakterien10 haben könnten. Insbesondere aufgrund der hervorragenden antimikrobiellen Eigenschaft werden Kupferoxid-Nanopartikel (CuO-NPs) häufig in antimikrobiellen Textilien, Holzschutzmitteln, Antifouling-Farben und landwirtschaftlichen Bioziden eingesetzt11,12. Es wurde berichtet, dass die weltweite Produktion von CuO-NPs im Jahr 2014 570 Tonnen betrug und die geschätzte Produktion bis zum Jahr 2025 bei 1600 Tonnen liegen würde13. Daher führt die zunehmende Produktion und Nutzung von CuO-NPs zu deren absichtlicher oder unbeabsichtigter Freisetzung in die Umwelt14. Obwohl die Toxizität von CuO-NPs für einige Modellorganismen wie menschliche Zellen oder Algen umfassend untersucht wurde15,16, wurde der Hauptgrund auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)4 zurückgeführt, die zu DNA-Schädigungen führen könnten Genregulation9,15. Es ist bekannt, dass Proteine, die Endprodukte der Genexpression, die Endausführer spezifischer biologischer Prozesse sind, wie etwa die Katalyse von Stoffwechselreaktionen und den Transport von Substanzen. Sobald die Proteinexpression erheblich beeinträchtigt würde, würden sich daher das Wachstum und die globalen Stoffwechselprozesse verändern17.

Während der Denitrifikation muss die extrazelluläre Kohlenstoffquelle (z. B. Glukose) in die Zellen transportiert werden, bevor sie für mikrobielles Wachstum und Denitrifikation genutzt werden kann18,19,20. Es ist gut dokumentiert, dass der Transportprozess von Glukose durch die Zusammenarbeit mehrerer wichtiger Proteine erfolgt, wie etwa des Solute-Binding-Proteins (GtsA), des Inner-Membran-Proteins (GtsB und GtsC) und des ATP-Binding-Proteins (MalK)21. Darüber hinaus handelt es sich bei der bakteriellen Denitrifikation um eine Reihe aufeinanderfolgender Redoxreaktionen, die auf einem Elektronentransfer beruhen. In der Elektronentransferkette werden Elektronen nacheinander von Elektronentransferproteinen wie Cytochrom bc1, Cytochrom c und denitrifizierenden Enzymen abgegeben22. Darüber hinaus katalysieren vier wichtige denitrifizierende Enzyme, Nitratreduktase (NAR), Nitritreduktase (NIR), Stickoxidreduktase (NOR) und Lachgasreduktase (N2OR), nacheinander die Reduktionsreaktionen von Nitrat zu Stickstoff. Frühere Studien zeigten, dass die Veränderungen wichtiger Elektronentransportproteine oder denitrifizierender Enzyme die Denitrifikationsleistung beeinflussten23,24,25. Der Einfluss von technisch hergestellten Nanomaterialien auf die Expression und Funktion von denitrifizierenden intrazellulären funktionellen Proteinen von Bakterien wurde jedoch selten dokumentiert.

In dieser Studie wurden die möglichen Auswirkungen von CuO-NPs auf die Denitrifikation untersucht und die Mechanismen unter dem Aspekt der Regulierung der intrazellulären Proteinexpression untersucht. Paracoccus denitrificans ist weit verbreitet in Böden, Wasser und Sedimenten26 und kann eine sequenzielle Reduktion von Nitrat, Nitrit, Stickoxid und Lachgas zu Distickstoffgas durchführen27. Somit gilt P. denitrificans als hervorragendes Modell denitrifizierender Bakterien zur Bestimmung der Auswirkungen auf die biologische Denitrifikation28. Die Einflüsse von CuO-NPs auf die Zellmorphologie und Strukturintegrität wurden mittels Transmissionselektronenmikroskop (TEM) und Laktatdehydrogenase (LDH)-Freisetzungsassays untersucht. Die Technik der isobaren Tags für die relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) lieferte die gesamten Proteominformationen, und Analysen der Gene Ontology (GO) und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) klassifizierten die unterschiedlich exprimierten Proteine in zelluläre Funktionen und Prozesse. Die Regulationsänderungen in intrazellulären Proteinen, die an einigen lebenswichtigen Funktionen beteiligt sind, die eng mit der Denitrifikation zusammenhängen, wurden durch Quantifizierung durch Multiple Reaction Monitoring (MRM) weiter bestätigt.

Denitrifizierende Bakterien (wie in dieser Studie Paracoccus denitrificans) nutzen eine Kohlenstoffquelle (wie Glukose) und Nitrat als Elektronendonor bzw. Elektronenakzeptor, um den Denitrifikationsprozess unter anaeroben Bedingungen durchzuführen, bei dem Nitrat Schritt für Schritt zu Nitrit, Stickoxid, reduziert wird , Lachgas und schließlich Stickstoff22. In dieser Studie sind die Auswirkungen von CuO-NPs auf die Variationen von NO3−, NO2− und N2O in Abb. 1 dargestellt. In der Kontrolle (ohne Anwesenheit von CuO-NPs) wurde Nitrat schnell reduziert und die endgültige Nitratentfernungseffizienz betrug 98,4 %. In Gegenwart von 0,05 mg/L CuO-NPs betrug die Nitratentfernungseffizienz 99,1 %, was keinen signifikanten Unterschied zur Kontrolle zeigte. Mit der Erhöhung der CuO-NPs auf 0,10 bzw. 0,25 mg/L sank die Nitratentfernungseffizienz jedoch auf 87,7 % bzw. 65,6 %.

Auswirkungen von CuO-NPs auf die Variationen von NO3−-N (fest, A), NO2−-N (hohl, A) und N2O-N (B) während 24-Stunden-Expositionstests.

Fehlerbalken stellen Standardabweichungen von Dreifachmessungen dar.

Obwohl während des Denitrifikationsprozesses eine vorübergehende Anreicherung von Nitrit beobachtet wurde, war nach 24 Stunden in Abwesenheit (Kontrolle) und Anwesenheit von 0,05 mg/L CuO-NPs kein Nitrit nachweisbar. Die endgültige Nitritkonzentration betrug jedoch 6,94 bzw. 9,54 mg/L bei CuO-NPs von 0,10 bzw. 0,25 mg/L. Aus Abb. 1B ist ersichtlich, dass die maximale N2O-Akkumulation mit der Zunahme der CuO-NPs abnahm, am Ende der Experimente jedoch kein nachweisbares N2O auftrat, unabhängig davon, ob CuO-NPs vorhanden waren oder nicht. Somit zeigten die Daten dieser Studie, dass das Vorhandensein von CuO-NPs zu einer geringeren Effizienz der Nitratreduktion führte und eine höhere Nitritakkumulation und eine geringere N2O-Emission während der Denitrifikation verursachte. Im folgenden Text wurden die Gründe dafür untersucht, dass CuO-NPs die Denitrifikation hemmen.

Normalerweise wurde die Toxizität von Metalloxid-Nanopartikeln auf die Freisetzung von Ionen29,30 oder die geringe Größe der Nanopartikel31 zurückgeführt. Daher wurde das gelöste Cu2+ aus CuO-NPs in mineralischen Medien gemessen und die Auswirkungen der Kupferionenkontrolle auf P. denitrificans untersucht. Die Auflösungsdaten zeigten, dass die gelöste Ionenkonzentration von der NP-Dosis und -Zeit abhängt (Abbildung S1A, Zusatzinformationen). Im Detail wurden nach 24-stündiger Auflösung 0,0069, 0,0115 und 0,0149 mg/L Cu2+ in den Medien für 0,05, 0,1 und 0,25 mg/L CuO-NPs nachgewiesen und die entsprechenden Auflösungsverhältnisse betrugen 13,82 %, 11,51 % bzw. 5,96 %. Dann zeigten die Ergebnisse des Ionentoxizitätstests in Abbildung S1B (in den ergänzenden Informationen), dass das Vorhandensein von Cu2+ im Bereich von 0,0069 (gelöst von 0,05 mg/L CuO-NPs) bis 0,0149 mg/L (gelöst von 0,25 mg/L CuO) vorlag NPs) verursachten unbedeutende Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit von P. denitrificans (p > 0,05). Außerdem wurden die Denitrifikationsprozesse von P. denitrificans mit oder ohne Anwesenheit von Kupferionen untersucht (Abbildung S1C und Abbildung S1D in den Zusatzinformationen), und Cu2+ hatte keine signifikanten Auswirkungen auf die Reduktion von NO3−-N und NO2−N und die endgültige N2O-Konzentration. Ebenso hemmte die Anwesenheit von Cu2+ nicht die katalytische Aktivität denitrifizierender Enzyme (Abbildung S2 in den Zusatzinformationen). Daher war Cu2+ nicht für den schwerwiegenden Einfluss von CuO-NPs auf P. denitrificans verantwortlich, und in der Literatur wurden ähnliche Schlussfolgerungen gezogen9,16. Im kommenden Text wurde der toxische Mechanismus aus der Wechselwirkung zwischen CuO-NPs und Bakterien entwickelt.

Frühere Studien haben berichtet, dass einige Nanopartikel (z. B. TiO2-NPs) aufgrund ihrer Adsorptionseigenschaft leicht an der Zelloberfläche haften können, was zu ihrer toxischen Wirkung führt32,33. In dieser Studie zeigten die Rasterelektronenmikroskopbilder (REM) mit energiedispersiver Spektroskopie (EDS)-Analyse, dass CuO-NPs auf der Oberfläche von P. denitrificans adsorbieren könnten (Abb. 2B). Die Daten in Abb. 2C zeigten, dass das Vorhandensein von CuO-NPs die LDH-Freisetzung von P. denitrificans verursachte und die Menge an freigesetztem LDH mit zunehmender CuO-NP-Konzentration zunahm. Im Allgemeinen ist LDH ein stabiles Enzym, das im Zytoplasma vorkommt, und seine Freisetzung wird als Marker für die Membranleckage verwendet, da das intrazelluläre LDH bei einer Schädigung der Zellmembran in die Zellkultur freigesetzt würde31. In dieser Studie zeigte die durch die Exposition gegenüber CuO-NPs induzierte LDH-Variation, dass CuO-NPs die Integrität der Bakterienmembran beeinträchtigten und Membranschäden verursachten. Außerdem wurde beobachtet, dass das Wachstum und die Lebensfähigkeit von P. denitrificans gehemmt wurden (Abbildung S3, Zusatzinformationen). Die Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskop-Energiedispersionsspektrometer (TEM-EDS) ergab, dass sich in P. denitrificans CuO-NPs befanden (Abb. 2E), was darauf schließen lässt, dass Nanopartikel in die Zellen eingedrungen sind.

Einfluss von CuO-NPs auf die Zellstruktur von P. denitrificans.

SEM-Bild von Bakterien (A), SEM-Bild und EDS-Analyse von Bakterien, die 0,25 mg/L CuO-NPs ausgesetzt waren (B), LDH-Freisetzung von Bakterien, die unterschiedlichen CuO-NPs-Dosen ausgesetzt waren (C), TEM-Bild einer Bakterienzelle ohne CuO-NPs-Exposition (D) und TEM-Bild und EDS-Analyse von Zellen, die 0,25 mg/L CuO-NPs ausgesetzt waren (E).

Es ist bekannt, dass große Mengen an Proteinen in Bakterien für verschiedene biologische Funktionen verantwortlich sind. Beispielsweise beruht die Aufnahme von Kohlenstoffquellen und Spurenelementen aus extrazellulären Umgebungen auf Transportproteinen21,34. Bei denitrifizierenden Bakterien hängt die Denitrifikationsreaktion stark von den Proteinen ab, die an der Elektronentransferkette beteiligt sind. Da sich CuO-NPs in P. denitrificans befanden und der Zellstoffwechsel vom Schicksal der Proteine abhängt, wurde im folgenden Text eine proteomische Methode basierend auf der MS-Technik übernommen, um die zugrunde liegenden Mechanismen von CuO-NPs zu untersuchen, die die Denitrifikation beeinflussen.

Die iTRAQ-Analysedaten zeigten, dass 7976 einzigartige Peptide und 1449 Proteine identifiziert wurden. Im Vergleich zur Kontrolle (Zellen ohne CuO-NP-Exposition) gab es nach 24-stündiger Exposition gegenüber 0,25 mg/l CuO-NPs 138 unterschiedlich exprimierte Proteine (62 herunterregulierte und 76 hochregulierte). Da die Annotation der Genontologie (GO) wichtige Informationen über Proteine liefern könnte, die an biologischen Prozessen, zellulären Komponenten und molekularen Funktionen beteiligt sind35, wurden in dieser Studie die identifizierten 138 unterschiedlich exprimierten Proteine den GO-Begriffen zugeordnet. Abbildung S4 (Ergänzende Informationen) zeigte, dass die unterschiedlich exprimierten Proteine hauptsächlich mit der katalytischen Aktivität, Bindung und Transporteraktivität auf der Ebene der molekularen Funktion zusammenhängen. Basierend auf den Stoffwechselprozessen, an denen verschiedene Proteine beteiligt waren, zeigten die Ergebnisse der Annotation „Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes“ (KEGG), dass die meisten durch CuO-NPs induzierten differentiell exprimierten Proteine dem ATP-Bindungskassettentransporter (ABC) zugeordnet wurden (Abbildung S5). , Ergänzende Angaben). Die mit diesem Prozess verbundenen Proteine gehörten zu den größten Proteinfamilien mit vielfältigen physiologischen Funktionen. Offenbar beeinflusste die Anwesenheit von CuO-NPs zelluläre Stoffwechselprozesse wie katalytische Reaktionen und Transport.

Für ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden zellulären Reaktionen, die durch CuO-NPs ausgelöst werden, wurde der STRING-Algorithmus (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)36 zum Aufbau von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken verwendet. Die durch 0,25 mg/L CuO-NPs induzierten unterschiedlich exprimierten Proteine sind in Abb. 3 dargestellt und die Linien zeigen die Wechselwirkungen verschiedener Proteine. Die Proteine wurden anhand spezifischer biologischer Funktionen identifiziert und klassifiziert, und es war klar, dass der Stickstoffstoffwechsel, der Elektronentransfer und der Transport drei vorherrschende Funktionen waren, die für die meisten regulierten Differenzialproteine, die zu diesen Kategorien gehörten, betroffen waren. Bei denitrifizierenden Bakterien beruhte der Denitrifikationsprozess auf dem Stickstoffstoffwechsel, sodass die beeinträchtigte Expression von Proteinen in dieser Kategorie einen direkten Einfluss auf die Denitrifikationsleistung haben könnte. Darüber hinaus war die Umwandlung von Nitrat in Distickstoff eine Reihe aufeinanderfolgender Reduktionsreaktionen, die die Beteiligung eines Elektronentransfers erforderten. Es ist anzunehmen, dass der Elektronentransfer eng mit der Stickstoffumwandlung verbunden war und diese starke Wechselwirkung auch im Netzwerk beobachtet wurde (Abb. 3). Darüber hinaus zeigten Transportproteine, die die Rolle von Transportsubstanzen (z. B. Nährstoffsubstanzen und Ionen) für Wachstum und Denitrifikation spielen, unter CuO-NPs-Stress unterschiedliche Expressionen. Daher induzierte die Exposition gegenüber CuO-NPs die Regulierung von Stickstoff-Stoffwechselproteinen, Elektronentransferproteinen und Transportproteinen, was die Denitrifikation direkt oder indirekt stören würde.

Das durch CuO-NPs induzierte Interaktionsnetzwerk unterschiedlicher Proteine.

Das Netzwerk wurde durch den STRING-Algorithmus erstellt und starke Interaktionen werden durch dickere Linien dargestellt.

Abb Transportsystem ATP-bindendes Protein (MalK)34. Anschließend durchläuft die intrazelluläre Glukose den Glykolyseprozess und wird unter Bildung von NADH (dem direkten Elektronendonor) für die anschließende Denitrifizierung abgebaut. Abbildung 4A zeigt, dass das Expressionsniveau von GtsB 80 % der Kontrolle betrug und die Herunterregulierung durch die MRM-Quantifizierung bestätigt wurde. Abbildung 4B zeigt außerdem, dass die Nutzung von Glukose mit der Erhöhung der CuO-NP-Dosierung abnahm, d. h. von 1,96 (Kontrolle) auf 1,80 (0,10 mg/L CuO-NPs) und 1,58 g/L (0,25 mg/L CuO-NPs). Nachdem Glukose in Bakterien transportiert wurde, wird sie abgebaut und NADH entsteht. Aus Abbildung S7 (Ergänzende Informationen) ist ersichtlich, dass die Expression von Enzymen, die am Glykolyseprozess beteiligt sind, nicht beeinträchtigt wurde, was darauf hindeutet, dass die Exposition gegenüber CuO-NPs den Glukoseabbau nicht störte. Die Daten in Abb. 4C zeigten jedoch, dass der intrazelluläre NADH-Spiegel bei CuO-NPs von über 0,05 mg/L deutlich abnahm und die Hemmwirkung mit zunehmender Dosierung verstärkt wurde. Daher führte die Hemmung der Glukosetransportproteine dazu, dass weniger Glukose für den intrazellulären Stoffwechsel der Bakterien verfügbar war, was wiederum auf die verminderte NADH-Erzeugung zurückzuführen war.

Relative Expression von Glukosetransportproteinen denitrifizierender Bakterien (A), Glukoseverwertung in Abwesenheit und Anwesenheit von CuO-NPs (B) und relativer intrazellulärer NADH-Spiegel von P. denitrificans nach Exposition gegenüber CuO-NPs (C).

Beim Denitrifikationsprozess enthalten große Mengen an Metalloproteinen (wie Cytochrom, Dehydrogenase und Reduktase) ein Eisenatom, das als aktives Zentrum für Redoxreaktionen fungiert. Es wurde berichtet, dass P. denitrificans-Zellen Eisen für die Metalloproteinsynthese aus extrazellulären Umständen über Eisenhydroxamataufnahmeproteine (Fhu) aufnehmen, die aus dem Substratbindungsprotein FhuD, dem Permeaseprotein FhuB und dem ATP-Bindungsprotein FhuC bestehen (Abb. 5A). Da die Synthese lebenswichtiger eisenhaltiger Proteine vom zellulären Eisentransport abhängt38, wurde der Einfluss von CuO-NPs auf die Expression von Eisentransportproteinen untersucht. Das Expressionsniveau des Proteins FhuD unter 0,25 mg/L CuO-NPs-Stress betrug 60,6 % der Kontrolle, was darauf hindeutet, dass CuO-NPs eine signifikante Herunterregulierung des Eisentransportproteins verursachten. Die Hemmung der Eisenaufnahme wurde durch die intrazelluläre Eisenquantifizierung weiter verifiziert und CuO-NPs reduzierten das intrazellulär verfügbare Eisen signifikant, da die mittlere Fluoreszenzintensität, die von der Eisenbindungssonde emittiert wurde, von 4660 (Kontrolle) auf 1903 (bei Anwesenheit von 0,25 mg/L CuO) sank NPs) in Abb. 5B.

Darstellung des Eisentransports und seiner Rolle bei der Fe-S-Proteinsynthese in P. denitrificans (A), die Fluoreszenzintensitätsverteilung der Eisenbindungssonde in Bakterien ohne CuO-NPs-Behandlung (oben) und exponiert gegenüber 0,25 mg/L CuO NPs (das untere Panel) durch Durchflusszytometrie-Analyse (B).

Wie in Abb. 6A dargestellt, werden im Elektronentransferprozess Elektronendonoren durch NADH-Dehydrogenase und Succinat-Dehydrogenase katalysiert und die erzeugten Elektronen werden an Ubichinon und den Cytochrom-BC1-Komplex abgegeben und schließlich über Cytochrom c22,39 auf wichtige denitrifizierende Enzyme übertragen. Für ein umfassendes Verständnis der Auswirkungen von CuO-NPs auf die Denitrifikation wurde das Schicksal von Proteinen untersucht, die am Elektronentransferprozess beteiligt sind. Aus Abb. 6B ist ersichtlich, dass das Vorhandensein von CuO-NPs mehrere Proteine in der Elektronentransferkette erheblich beeinflusste. Die Expression von zwei Untereinheiten der NADH-Dehydrogenase (d. h. NADH-Flavinoxidoreduktase und Elektronentransfer-Flavoprotein-Untereinheit Alpha) in Gegenwart von 0,25 mg/L CuO-NPs betrug 78,8 % bzw. 88,6 % der Kontrolle. Die Expression von Cytochrom c, Cytochrom c1, der Ubiquinol-Cytochrom-C-Reduktase-Eisen-Schwefel-Untereinheit und SCO1/SenC betrug 53,5 %, 84,4 %, 85,7 % bzw. 66 % der Kontrolle, die alle eine Herunterregulierung zeigten, wenn sie CuO-NPs ausgesetzt wurden . Das Vorhandensein von CuO-NPs induzierte eindeutig die herunterregulierte Expression von Schlüsselproteinen, die an der Elektronentransferkette beteiligt sind, was zu einer geringen Elektronentransfereffizienz für nachfolgende Denitrifikationsreaktionen führte.

Darstellung des Elektronentransfers und der Stoffumwandlung im Denitrifikationsprozess (A), des relativen Expressionsniveaus der an der Denitrifikation beteiligten Proteine (B), der Auswirkungen der CuO-NPs-Exposition auf die Aktivitäten von NAR, NIR, NOR und N2OR zum Zeitpunkt von 24 Stunden ( C).

Fehlerbalken stellen Standardabweichungen von Dreifachmessungen dar und Sternchen zeigen eine signifikante Reduzierung im Vergleich zu Kontrollproben an (p < 0,05).

Nach der Übertragung durch einen Elektronenträger werden die Elektronen für Reduktionsreaktionen an spezifische denitrifizierende Enzyme abgegeben. Bei Denitrifikationsreaktionen übernimmt NAR die Funktion der Nitratreduktion und dieses Enzym besteht aus drei Untereinheiten (α, β und γ)40. Elektronen werden von der γ-Untereinheit zur β-Untereinheit und schließlich zur α-Untereinheit, dem aktiven Zentrum für die Nitratreduktion, übertragen. Abbildung 6B zeigt, dass sowohl die Expression der α-Untereinheit als auch der β-Untereinheit von NAR in Gegenwart von CuO-NPs auf 84,7 % bzw. 82,5 % der Kontrolle verringert wurden und die enzymatischen Lebensfähigkeitstests die geringere katalytische Aktivität von NAR, die durch CuO-NPs induziert wird, bestätigten (Abb. 6C). Unterdessen wurde die Expression der Nitritreduktase um 29,2 % herunterreguliert und ein ähnliches abnehmendes Muster der NIR-Aktivität ist in Abb. 6C dargestellt. Diese Ergebnisse stimmten mit den Beobachtungen überein, dass CuO-NPs eine stärkere Anreicherung von Nitrat und Nitrit hervorriefen. Darüber hinaus induzierten CuO-NPs die hochregulierte Expression (167 %) und erhöhten die Aktivität der Lachgasreduktase, was auf die Freisetzung von Spuren von Cu2+ (0,016 mg/L) aus 0,25 mg/L CuO-NPs zurückgeführt wurde, da diese vorhanden waren Berichten zufolge spricht es für die katalytische Aktivität von N2OR41,42. Diese Daten erklärten das Phänomen, dass die maximale Anreicherung von N2O mit zunehmender CuO-NP-Dosierung abnahm (Abb. 1B).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Vorhandensein von CuO-NPs erhebliche Auswirkungen auf die Denitrifikationsfunktion von P. denitrificans haben könnte, wie z. B. eine geringere Nitratreduktion, eine stärkere Nitritakkumulation und eine geringere maximale Lachgasakkumulation. Die beschädigte Membran führte zum Eindringen von CuO-NPs in Bakterien und dann wurde die proteomische Veränderung durch intrazelluläre CuO-NPs induziert. Bioinformatische Analysen zeigten, dass einige lebenswichtige Stoffwechselfunktionen oder -wege, wie der Stofftransport, der Elektronentransfer und die katalytische Aktivität, durch CuO-NPs erheblich beeinflusst wurden. Insbesondere wurden die Glukosetransportproteine herunterreguliert, was zu weniger Elektronendonor-NADH für die Denitrifikation führte. Außerdem führte die Einschränkung der Eisenaufnahme dazu, dass weniger Eisen verfügbar war, was sich negativ auf die Synthese und Funktion eisenhaltiger Proteine im Denitrifikationsprozess auswirkte. In der Elektronentransferkette wurden auch mehrere wichtige Elektronentransferproteine und denitrifizierende Enzyme durch CuO-NPs beeinflusst, und Enzymaktivitätsmessungen stimmten mit der Herunterregulierung von NAR und NIR und der Hochregulierung von N2OR überein. Alle diese Beobachtungen standen im Einklang mit der durch CuO-NPs induzierten verminderten Denitrifikationsleistung.

CuO-NPs (Partikelgröße <50 nm) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) gekauft. Die Röntgenbeugungsanalyse (XRD) wurde mit einem Bruker D8 Advance-Diffraktometer mit einer Cu-Kα-Strahlungsquelle durchgeführt. Das Ergebnis ist in Abbildung S8 (Ergänzende Informationen) dargestellt. Die pulverförmigen CuO-NPs wurden in Alkohol mit Ultraschall behandelt und dann zur TEM-Analyse in Ni-Gitter getropft (Abbildung S9, Zusatzinformationen). Außerdem wurde die NP-Stammsuspension mit 50 mg/l durch Dispergieren von 0,05 g NP-Pulver in 1 l Milli-Q-Wasser und anschließender einstündiger Ultraschallbehandlung (25 °C, 500 W, 40 kHz) hergestellt. Die Größenverteilung der Partikel in der Stoffsuspension wurde durch Laserbeugungstechnik mit einem Mastersizer 3000 (Malvern UK) bestimmt.

Der Stamm Paracoccus denitrificans (ATCC 19367) kommt in Wasser- und Bodenumgebungen häufig vor und der Stoffwechselmechanismus ist für die Forschung gut verstanden22. In dieser Studie wurde Paracoccus denitrificans als denitrifizierende Testmikrobe eingesetzt, die von der American Type Culture Collection erworben wurde. Vor der Exposition gegenüber CuO-NPs wurde P. denitrificans 24 Stunden lang in Difco-Nährbrühe bei 30 °C in einem Schüttler unter konstantem Rühren (200 U/min) aerob kultiviert. Anschließend wurden die Bakterien für die folgenden Expositionstests aus dem Nährmedium geerntet.

Zunächst wurde Mineralmedium in Serumflaschen hergestellt und die Zusammensetzung entsprach der Referenz mit geringfügiger Modifikation (g/L): Glucose, 5,0; K2HPO4, 7,0; KH2PO4, 3,0; Natriumcitrat·2H2O, 0,5; MgSO4·7H2O, 0,1; (NH4)2SO4, 1,0; KNO3, 2,16 und Spurenelementlösung von 50 μL/L28. Die Spurenelementlösung enthielt (g/L): CaCl2·2H2O, 7,4; MnSO4·H2O, 1,0; ZnSO4·7H2O, 3,6; CoCl2·6H2O, 0,4; FeCl3·6H2O, 0,96; CuCl2·2H2O, 0,03; H3BO3, 0,3; NiCl2·6H2O, 0,01; EDTA-Na2, 3,7. Laut Referenz wurde Ammoniumsulfat verwendet, um eine assimilatorische Nitratreduktion auszuschließen und sicherzustellen, dass der Nitratverbrauch durch die Atmung verursacht wurde23. Alle Serumflaschen und zugehörigen Geräte wurden in einem Hochdruckdampfsterilisationstopf sterilisiert und anschließend 20 Minuten lang mit ultravioletten Strahlen desinfiziert. In einer anaeroben Kammer wurde dem Mineralmedium eine CuO-NP-Stammsuspension zugesetzt und anschließend wurden Bakterienkulturen mit einem anfänglichen optischen Dichtewert (OD600) von 0,05 inokuliert. Nach guter Vorbereitung wurden die Serumflaschen in einen Schüttler (200 U/min) mit einer konstanten Temperatur von 30 ± 1 °C gegeben und alle 4 Stunden wurden die Proben zur Analyse entnommen.

Nach 24-stündiger Exposition gegenüber 0 oder 0,25 mg/L CuO-NPs wurden dreifache Proben aus jeder Serumflasche entnommen und dann für den iTRAQ-Test gemischt. Die Bakterienpellets wurden zunächst durch Zentrifugation bei 5000 U/min gewonnen. Nach der Zugabe des vorbereiteten STD-Puffers (enthaltend 4 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 150 mM Tris-HCl (pH 8,0)) wurden die Proben durch Vortex-Mischen, 5-minütiges Erhitzen im Wasseransatz und Schallzerstörung (80 W) behandelt , 10 s Betrieb und 15 s Pause für 10 Zyklen). Schließlich wurde der Überstand durch Zentrifugation (4 °C, 15.000 U/min, 10 Min.) gesammelt, nachdem die Wassercharge erhitzt und die Proteinkonzentration nach der Methode von Lowry et al.43 bestimmt wurde.

Die extrahierten Proteine wurden gemäß der Referenz44 verdaut. Kurz gesagt, 400 μg Protein jeder Probe wurden in 30 μl STD-Puffer (4 % SDS, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 100 mM Dithiotreitol) verdünnt. Anschließend wurde die Lösung 5 Minuten lang in kochendem Wasser inkubiert, auf Raumtemperatur abgekühlt, mit 200 μl UA-Puffer (8 M Harnstoff, 150 mM Tris-HCl (pH 8,0)) verdünnt und zur Ultrafiltration in einen 10 kD-Filter überführt. Die Proben wurden 15 Minuten lang bei 14000 g (4 °C) zentrifugiert, mit 200 μL UA-Puffer versetzt und erneut zentrifugiert. Nach Zugabe von 100 μl Iodacetamid (50 mM in UA-Puffer) wurden die Proben 20 Minuten lang in Dunkelheit gelegt, unter den oben genannten Bedingungen zentrifugiert und zweimal mit UA-Puffer gewaschen. 10 μl DS-Puffer (50 mM Triethylammoniumbicarbonat, pH 8,5) wurden zu den Proben gegeben und dann zentrifugiert (14.000 g für 15 Minuten bei 4 °C). Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Abschließend wurden 40 μL Trypsin (5 μg Trypsin in 40 μL DS-Puffer) zugegeben und die Proben 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die resultierenden Peptide wurden vor der Zentrifugation in neuen Röhrchen gesammelt und der Peptidgehalt bei 280 nm gemessen.

Nach der Verdauung wurden 80 μg Peptid mit iTRAQ-Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers (Applied Biosystems, USA) markiert. Die Proben Nr. 1 (ohne CuO-NP-Exposition) und Nr. 2 (mit 0,25 mg/L CuO-NP-Exposition) wurden jeweils mit den Reagenzien 114 und 115 umgesetzt, und dann wurden die markierten Proben gemischt und 1/5 der Mischung mit einer C18-Kartusche entsalzt (Sigma), bevor es im Vakuum getrocknet wird.

Der Trennungsprozess wurde mit dem Nanopumpen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem (HPLC) Easy nLC durchgeführt. Die Säule wurde mit 95 % (v/v) Puffer A (0,1 % (v/v) Ameisensäure) äquilibriert und dann wurden die Proben in zwei Thermo Scientific EASY-Säulensäulen (2 cm × 100 μm 5 μm-C18; 75) injiziert μm × 100 mm 3 μm-C18) nacheinander mit einer Flussrate von 250 nL/min. Die Peptide wurden mit Puffer B (0,1 % Ameisensäure und 84 % Acetonitril in MilliQ-Wasser) gemäß dem folgenden segmentierten Gradienten getrennt: 0–55 % für 220 Minuten, 55 %–100 % für 8 Minuten und schließlich 100 % für 12 Minuten.

Nach der Trennung wurden die Proben 240 Minuten lang mit einem Q-Exactive-Massenspektrometer (Thermo Finnigan, USA) (mit einem Massenbereich von 300–1800 m/z) im Positivionenmodus analysiert. Vermessungsscans wurden mit einer Auflösung von 70.000 für den MS-Scan und 17.500 für den MS/MS-Scan bei m/z 200 und einem Isolationsfenster von 1,6 m/z aufgenommen. Die maximalen Ioneninjektionszeiten betrugen 10 bzw. 60 ms für MS und MS/MS, und das Ziel der automatischen Verstärkungsregelung (AGC) wurde auf 3E6 eingestellt. Weitere Parameter waren wie folgt: dynamischer Ausschluss 40 s, Unterfüllungsverhältnis 0,1 % und Kollisionsenergie 30 eV.

Die Rohdaten der MS/MS-Spektren wurden mit Mascot 2.2 und Proteome Discoverer 1.4 für die Datenbanksuche und quantitative Analyse verarbeitet. Die MASCOT-Parameter wurden wie folgt eingestellt: Peptid-Massentoleranz, 20 ppm; Fragmentmassentoleranz, 0,1 Da; max. verpasste Spaltungen, 2. Alle Daten basierten auf mindestens einem eindeutigen Peptid mit 99 % Konfidenz und die Proteinidentifizierung wurde durch eine Falscherkennungsrate (FDR) ≤ 1 % als Screen-Schwellenwert für Peptid nach massenspektrometrischer Analyse und Datenbank-Mascot-Suche bestimmt45.

Den iTRAQ-Ergebnissen zufolge wurden mehrere wichtige differenziell exprimierte Proteine (siehe Tabelle S1, Ergänzende Informationen) ausgewählt und durch Mehrfachreaktionsüberwachung (MRM) quantifiziert. Für die MRM-Analyse waren die grundlegenden Anforderungen an ausgewählte Peptide wie folgt: 10–15 Aminosäuren lang, einzigartiges Peptid unterschiedlicher Proteine, keine posttranslationale Proteinmodifikation (wie Methioninoxidation und Cystein-Alkylierung) und hohe Zählzahlen in den iTRAQ-Tests. Als interner Standard wurde der Proteintranslationsinitiationsfaktor IF-2 verwendet. Kurz gesagt, nach der Trennung durch HPLC wurde eine MS-Analyse der Proben mit dem AB SCIEX QTRAP 5500-System durchgeführt, das mit der Nanospray III-Quelle verbunden war, und für jede Probe wurden dreifache LC-MS/MS-Läufe durchgeführt. Die Parameter für die MS-Analyse waren wie folgt: positiver Ionenmodus für 60 Minuten, Massenbereich von 100–1000 m/z und Massentoleranz 250 mDa. Rohe Quantifizierungsdaten wurden mit der AB SCIEX ProteinPilot 4.5-Software mit einer Konfidenzbeschränkung von >0,95 bestätigt und die Peptidübergangsintensität wurde mit der Software Skyline 2.5.0 (University of Washington) quantitativ analysiert. Im MRM-Quantifizierungstest wurden dreifache biologische Proben verwendet und die unterschiedlich exprimierten Proteine wurden im Vergleich zur Kontrolle als signifikant reguliert angesehen, wenn der p < 0,05.

Für die Messung der enzymatischen Aktivität wurden zunächst die rohen Zellextrakte hergestellt. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 5000 U/min geerntet, zweimal mit 100 mM PBS (pH 7,4) gewaschen und im gleichen Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde durch 5-minütige Ultraschallbehandlung bei 20 kHz aufgebrochen und anschließend wurden die Zelltrümmer durch 10-minütige Zentrifugation bei 12.000 U/min entfernt. Die aufbereiteten rohen Zellextrakte wurden sofort zur Bestimmung spezifischer Enzymaktivitäten verwendet. Alle oben genannten Vorgänge wurden bei 4 °C durchgeführt. Die Enzymaktivitäten basierten auf dem Proteingehalt und der Proteingehalt wurde nach der Methode von Lowry et al. bestimmt. mit Rinderserumalbumin als Standard43.

Die Testmischung für Reaktionen enthielt 10 mM PBS-Puffer (pH 7,4), 1 mM Methylviologen, 5 mM Na2S2O4 und 1 mM Reaktionssubstrat (KNO3, NaNO2, NO oder N2O). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,3 ml Rohzellextrakten gestartet und die Mischung sofort in einen Inkubator mit 30 °C gestellt. Die Daten wurden alle 10 Minuten mit einem Spektrophotometer (für NAR und NIR, Shimazu UV1800, Japan) oder Mikrosensoren (für NOR und N2OR, Unisense, Dänemark) erfasst. Schließlich wurden ihre Aktivitäten als μmol Substrat/(min·mg Protein) berechnet.

Laut Literatur wurde intrazelluläres Eisen mit der Fluoreszenzsonde Calcein-AM (Calcein-Acetomethoxy)46,47 bestimmt. Das permeierende Calcein-AM kann in Zellen eindringen, sich an intrazelluläres Eisen binden und in der eisenbindenden Form [CA-Fe] vorliegen, die bei 488-nm-Anregung Fluoreszenz emittiert. Zunächst wurden die Bakterienzellen durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 3500 U/min gewonnen und dann mit HEPES-Puffer (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure) (20 mM HEPES, 153 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM) gewaschen Glukose, pH 7,4) dreimal verabreicht. Zur Farbstoffmarkierung wurden die Zellen für eine 30-minütige Inkubation bei 37 °C auf 1 × 107 Zellen/ml in HEPES-Puffer mit 0,5 μM Calcein-AM eingestellt. Anschließend wurden die Zellen mit HEPES-Puffer gespült, um das extrazelluläre Calcein-AM zu entfernen, und dann zur Fluoreszenzdetektion mit dem gleichen Puffer in eine 96-Well-Platte geladen. Die durchflusszytometrische Analyse wurde mit einem BD Accuri C6 (USA) unter Verwendung eines 488-nm-Argonionenlasers durchgeführt und die Fluoreszenzemissionen wurden durch einen 530/30-nm-Breitbandfilter geleitet. Während des Nachweisprozesses wurden 10.000 Zellen gesammelt und die Fluoreszenzintensitäten zur Analyse gemessen.

Die Konzentrationen von NO3− und NO2− wurden mit einem Spektrophotometer gemäß den Standardmethoden48 bestimmt und die Glukose wurde mit der Anthron-H2SO4-Methode49 gemessen. Die Bestimmung von N2O wurde mit einem Gaschromatographen (GC) (Agilent 7820A, USA) mit einem Elektroneneinfangdetektor (ECD) durchgeführt. Das N2O im Gas wurde direkt entnommen und mit einer Spritze in den Probeneinlass des GC injiziert, und das in wässriger Lösung gelöste N2O wurde nach Verwendung des Kopfraums mit einer Gleichgewichtstemperatur und einer Gleichgewichtszeit von 25 °C bzw. 3 Stunden nachgewiesen. Die optische Dichte (OD600) der Bakteriensuspension wurde alle 4 Stunden mit einem Spektrophotometer (Shimadzu UV1800, Japan) bei 600 nm gemessen.

Der LDH-Freisetzungstest wurde verwendet, um die Membranintegrität für intrazelluläres LDH zu bestimmen, das in das extrazelluläre Medium freigesetzt würde, wenn die Zellmembran beschädigt wäre31. Das Cytotoxicity Detection Kit wurde von Roche Applied Science erworben und die Reaktionsmischung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers zubereitet. Nach 24-stündiger Einwirkung von CuO-NPs wurden die Kulturüberstände durch Zentrifugation (12000 U/min für 3 Minuten) erhalten und in eine Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Anschließend wurden 50 μl Reaktionsmischung für eine 30-minütige Inkubation bei 30 °C hinzugefügt. Schließlich wurden die Daten bei einer Absorption von 490 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (BioTek, USA) erhalten. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Im Einzelnen wurden 100 μl der Zellsuspensionen nach 24-stündiger Exposition erhalten und in eine Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, gefolgt von der Aussaat von 10 μl CCK-8 für 30 Minuten bei 30 °C. Anschließend wurde die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (BioTek, USA) aufgezeichnet.

SEM-Bilder wurden verwendet, um die Oberflächenmorphologie von mit CuO-NPs behandelten Bakterien zu erhalten, und das Verfahren zur Probenvorbereitung wurde in der Literatur dokumentiert50,51,52. Nach 24-stündiger Einwirkung von CuO-NPs wurden die Bakterienzellen 2 Stunden lang mit 2,5 % Glutaraldehyd fixiert, dreimal mit 0,1 M Phosphatpufferlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen und dann in einem Vakuum-Gefriertrockner getrocknet. Abschließend wurden die getrockneten Proben mit Gold zerstäubt und dann unter einem FEI Quanta 200 SEM bei 20 kV betrachtet, das mit energiedispersiver Spektroskopie (EDS) ausgestattet war. TEM wurde eingesetzt, um das intrazelluläre Vorhandensein von CuO-NPs zu untersuchen, und die Proben wurden gemäß der Literatur vorbereitet16,53. Die behandelten Bakterien wurden 2 Stunden lang mit 2,5 % Glutaraldehyd fixiert, 1 Stunde lang in 1 % Osminsäure nachfixiert, dreimal mit 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,4) gewaschen und in zunehmender Acetonkonzentration (30 %, 50 %) dehydriert. , 70 %, 90 % und 100 %) jeweils 20 Minuten lang. Anschließend wurden die Proben 5 Stunden lang bei 60 ° C mit reinem Harz durchdrungen und imprägniert, und es wurden ultradünne 60-nm-Schnitte für die anschließende Bildgebung mit einem Tecnai G2 (FEI, USA) mit einer Beschleunigungsspannung von 120 kV angefertigt.

Die Messung von intrazellulärem NADH erfolgte gemäß der Literatur54. Die Proben wurden durch Zentrifugation bei 15.000 U/min für 1 Minute erhalten und 300 μl 0,2 M NaOH wurden zugegeben, um die Pellets erneut zu suspendieren. Anschließend wurden die Proben 10 Minuten lang in ein Wasserbad mit 50 °C gelegt, auf Eis auf 0 °C abgekühlt und durch tropfenweise Zugabe von 300 μl 0,1 M HCl unter Vortexen neutralisiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 15.000 U/min wurden die Überstände für die folgende Messung verwendet. Die Testmischung enthielt gleiche Volumina 1,0 M Bicin-Puffer (pH 8,0), Ethanol, 40 mM EDTA (pH 8,0), 4,2 mM Thiazolylblau (MTT) und das doppelte Volumen 16,6 mM Phenazinethosulfat (PES) und wurde dann bei 30 °C inkubiert °C für 10 Min. Die Reaktionsmischung wurde aus folgenden Volumina hergestellt: 50 μl neutralisierter Zellextrakt, 0,3 ml destilliertes Wasser und 0,6 ml Testmischung. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 μl Alkoholdehydrogenase (ADH, 500 U/ml) gestartet und anschließend die Absorption bei 570 nm bei 30 °C aufgezeichnet. Die NADH-Konzentrationen wurden mit Standardlösungen von NADH kalibriert und die endgültigen intrazellulären NADH-Spiegel wurden basierend auf dem Proteingehalt berechnet.

Alle Tests wurden dreifach durchgeführt und die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Eine Varianzanalyse (ANOVA) wurde verwendet, um die Signifikanz der Ergebnisse zu testen, und p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Zitierweise für diesen Artikel: Su, Y. et al. Veränderung der intrazellulären Proteinexpression als Schlüsselmechanismus für die Verschlechterung der bakteriellen Denitrifikation durch Kupferoxid-Nanopartikel. Wissenschaft. Rep. 5, 15824; doi: 10.1038/srep15824 (2015).

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Diese Arbeit wurde finanziell von der National Science Foundation of China (51425802, 41301558 und 51578394), dem Program of Shanghai Subject Chief Scientist (15XD1503400) und dem Collaborative Innovation Centre for Regional Environmental Quality unterstützt.

Staatliches Schlüssellabor für Umweltverschmutzungskontrolle und Ressourcenwiederverwendung, Fakultät für Umweltwissenschaften und -technik, Tongji-Universität, 1239 Siping Road, Shanghai, 200092, China

Yinglong Su, Xiong Zheng, Yinguang Chen, Mu Li und Kun Liu

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YS, XZ und YC konzipierten und gestalteten die Experimente. YS, XZ, ML und KL führten die Experimente durch. YS, XZ, YC und ML analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und überprüften das Manuskript.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Su, Y., Zheng, X., Chen, Y. et al. Veränderung der intrazellulären Proteinexpression als Schlüsselmechanismus für die durch Kupferoxid-Nanopartikel verursachte Verschlechterung der bakteriellen Denitrifikation. Sci Rep 5, 15824 (2015). https://doi.org/10.1038/srep15824

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Eingegangen: 23. April 2015

Angenommen: 01. Oktober 2015

Veröffentlicht: 28. Oktober 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15824

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