Ein thermophiles chemolithoautotrophes Bakterienkonsortium deutet auf eine gegenseitige Beziehung zwischen Bakterien in extrem oligotrophen Umgebungen hin

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 230 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ein thermophiles, chemolithoautotrophes und aerobes Mikrobenkonsortium (Carbonitroflex genannt), das in einem nährstoffarmen Medium und einer Atmosphäre mit N2, O2, CO2 und CO wächst, wird als Modell untersucht, um unser Verständnis extremer biologischer Systeme zu erweitern. Hier zeigen wir, dass das Konsortium von Carbonactinospora thermoautotrophica (Stamm StC) dominiert wird, gefolgt von Sphaerobacter thermophilus, Chelatococcus spp. und Geobacillus spp. Die metagenomische Analyse des Konsortiums zeigt eine wechselseitige Beziehung zwischen Bakterien, wobei C. thermoautotrophica StC Carboxydotrophie und Kohlendioxidspeicherkapazität aufweist. C. thermoautotrophica StC, Chelatococcus spp. und S. thermophilus enthalten Gene, die für CO-Dehydrogenase und Formiatoxidase kodieren. Unter den ursprünglichen Wachstumsbedingungen wurden keine Reinkulturen erhalten, was darauf hindeutet, dass für das Überleben und Wachstum der Gruppe in diesem extrem oligotrophen System möglicherweise ein streng regulierter interaktiver Stoffwechsel erforderlich ist. Die Ernährerhypothese wird vorgeschlagen, um das Stoffwechselflussmodell zu erklären und die entscheidende Rolle von C. thermoautotrophica StC (der einzigen Schlüsselart und primären Kohlenstoffproduzenten) für das Überleben aller Konsortiumsmitglieder hervorzuheben. Unsere Daten können zur Untersuchung komplexer Wechselwirkungen in extremen Umgebungen beitragen und die Zusammenhänge und Abhängigkeiten innerhalb mikrobieller Gemeinschaften veranschaulichen.

Alle biogeochemischen Kreisläufe beinhalten mikrobielle Biosynthese, und Mikroben können die Kohlendioxidbindung und die Stickstofffixierung erheblich fördern1,2,3, die wesentliche gesellschaftliche Ziele sind4. Allerdings sind die mit der Biomassebildung verbundenen Mechanismen, die ihre komplexen Mikrobiome, komplizierten Wechselwirkungen und Funktionen umfassen, noch nicht vollständig aufgeklärt; und das Verständnis dieser Mechanismen bleibt eine große Herausforderung5,6,7.

Oligotrophe, ökosystembasierte mikrobielle Konsortien können als Modelle für die Untersuchung komplexer biotechnologischer Prozesse dienen und so unser Verständnis biologischer Systeme erweitern. Mikroorganismen kooperieren miteinander, um mit verschiedenen Bedingungen zurechtzukommen, wie z. B. begrenzter Nährstoffverfügbarkeit und/oder Stress8; Allerdings können extreme Umweltbedingungen zu stark voneinander abhängigen Wechselwirkungen in mikrobiellen Konsortien führen. Die wichtigsten biogeochemischen Prozesse, die dem Leben in diesen Systemen zugrunde liegen, können ebenfalls unterteilt werden. Ein besseres Verständnis dieser gegenseitigen Abhängigkeit und der Interaktionsmodi, die die Interaktionen in der mikrobiellen Gemeinschaft steuern9, könnte zur Entdeckung neuer Signalwege oder Gene führen10. Dieses Verständnis kann letztendlich zu neuartigen biotechnologischen Anwendungen führen11,12 durch die Optimierung und Entwicklung mikrobieller Konsortien zur Herstellung von Biomolekülen, Biokraftstoffen und Kohlenstoffbindung3,13,14 und durch die Nutzung der Prinzipien der mikrobiellen Ökologie15. Diese Fortschritte können zur Linderung entscheidender Probleme wie Klimawandel und Bevölkerungswachstum beitragen11,16,17.

Extremophile wie Carboxydotrophe können sich schnell weiterentwickeln, um sich an die dynamischen Veränderungen anzupassen, die unter extremen Bedingungen auftreten können, was sie zu guten Quellen für neuartige Bioprodukte macht18. Studien an oligotrophen Konsortien, die sich unter extremen Bedingungen entwickeln, sind ideal, um die organische Chemie des (frühen) Lebens auf der Erde oder anderen Planeten/Monden im Sonnensystem aufzuklären19,20.

In dieser Studie wurde ein thermophiles und oligotrophes Bakterienkonsortium erfolgreich aus dem Boden angereichert; Wir untersuchten die mikrobielle Zusammensetzung des Bakterienwachstums, um festzustellen, ob die extremen selektiven Bedingungen das angereicherte Bakterienkonsortium prägten, und um die Zusammenarbeit zwischen Mitgliedern des Konsortiums zur Anpassung an raue Bedingungen aufzuklären. Das Konsortium mit der Bezeichnung Carbonitroflex (CNF) wurde aus einer Bodenprobe mit einer jahrzehntelangen Geschichte wiederholter Grasverbrennungen (langfristige Einwirkung hoher Temperaturen und CO2 aus den Bränden) bereichert.

Zur Charakterisierung des mikrobiellen Konsortiums verwendeten wir einen mehrphasigen Ansatz. Die metagenomische Analyse des Konsortiums ermöglichte die Erstellung eines Modells, das Interaktionen und gegenseitige Beziehungen zwischen Bakterien erklärt, um ihr Überleben unter restriktiven Umweltbedingungen sicherzustellen. Das vorgeschlagene Stoffwechselmodell könnte den Hauptproduzenten (Ernährer) und andere Gruppen (Kollaborateure und Betrüger) in diesem Netzwerk identifizieren.

Das thermophile Bakterienkonsortium CNF wurde bei 55 °C aus dem Boden gewonnen, der unter einem Haufen verbrannten Grases gesammelt wurde und eine andere chemische Zusammensetzung aufwies als eine Bodenprobe aus einem nahegelegenen Wald. Der Boden der Brandstelle hatte deutlich höhere P- und K-Gehalte, einen deutlich höheren pH-Wert und ein C:N-Verhältnis (ergänzende Abbildung 1C). Das Konsortium war in der Lage, in einem mineralischen Medium ohne organische Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu wachsen und schwimmende weiße Häutchen zu bilden, und bei keiner der verwendeten Negativkontrollen wurde Wachstum beobachtet. Die ersten schwimmenden weißen Häutchen wurden 15 Tage nach Beginn der Isolierungsversuche nur in einer der beimpften Bodenproben beobachtet (Abb. 1a). Diese erste Kultur wurde dann weitere 15 Tage lang inkubiert. Das resultierende Wachstum erschien als weniger konzentrierte Häutchen schwimmender Zellagglomerate auf beiden Medien, festem N-FIX, ergänzt mit Klinoptilolith (Abb. 1b) und flüssigem N-FIX-Medium (Abb. 1c). Diese Kultur wurde dann alle 14 Tage in dreifache Fläschchen überführt (jedes Mal) für >3 Jahre. Die Zellagglomerate (schwebende weiße Häutchen) wurden durchgängig nach 3–21 Tagen in allen Replikaten über einen Zeitraum von >3 Jahren mittels Elektronenmikroskopie beobachtet. Filamentöse Bakterien mit intrazellulären Sporen wurden in Verbindung mit einer kleineren Anzahl einzelliger Kokken und Bazillen beobachtet. Diese Mikroben schienen eng miteinander verbunden zu sein (Abb. 1d), wobei sich unter den filamentösen Zellen bakterienförmige Bakterien festsetzten. Es wurden auch mehrere sporenartige Strukturen beobachtet, die direkt an die Zellfilamente der Bakterien gebunden waren (Abb. 1e). Mittels REM aufgenommene Bilder zeigten das Vorhandensein einer Zellauskleidung, bei der es sich möglicherweise um eine Brücke aus unbekanntem Material handelte, die die Zellen verband (Abb. 1f). Bemerkenswerterweise wurden auch hochsymmetrische bakterielle Mikrokompartimente (BMCs)/Carboxysomen-ähnliche Strukturen im zellulären Zytoplasma festgestellt (Abb. 2). Interessanterweise wurden im zellulären Zytoplasma regelmäßig geformte Cluster festgestellt. Diese rautenförmigen Cluster erschienen in mehreren Bildern und in unterschiedlichen Größen (wahrscheinlich aufgrund des Blockschnitts in unterschiedlichen Höhen). Genomische Daten deuten darauf hin (siehe unten), dass es sich dabei möglicherweise um Carboxysomen-ähnliche Strukturen handelt, bei denen es sich um bakterielle Mikrokompartimente handelt, die kohlenstofffixierende Enzyme konzentrieren und eine wesentliche Rolle im Prozess der Kohlenstofffixierung spielen21.

Anfängliches Wachstum aus Bodenproben. a Kolonien wachsen in mineralischem Medium, ergänzt mit NH4Cl; b Wachstum auf N-FIX-Medium, ergänzt mit Klinoptilolith; c Wachstum auf N-FIX-Medium, gefüllt mit synthetischer Luft, CO und CO2; d Konfokale Elektronenmikroskopaufnahme von Carbonitroflex, gewachsen in N-FIX-Medium ohne Stickstofffixierungsquellen (11.210-fache Vergrößerung), zeigt nicht-filamentöse Bakterien (gelber Pfeil), die sich auf filamentösem Wachstum von Aktinobakterien (roter Pfeil) ablagern; e Rasterelektronenmikroskopaufnahme, die die Details der sporenartigen Struktur zeigt (rote Pfeile) (51.000-fache Vergrößerung); und f Transmissionselektronenmikroskopaufnahme (71.000-fache Vergrößerung), die die Vakuolen (blaue Pfeile), die gut abgegrenzte Membran und die Zellwand (roter Pfeil) zeigt.

a Rote Pfeile zeigen Carboxysomen-ähnliche Strukturen im zellulären Zytoplasma von Carbonactinospora thermoautotrophica StC; ba Nahansicht einer Carboxysomen-ähnlichen Struktur; und c Das Fast Fourier Transform (FFT)-Bild der Carboxysomen-ähnlichen Struktur, das eine mathematische Darstellung der räumlichen Frequenzen des Bildes25 ist und zeigt, dass die StC-Carboxysomen-ähnliche Struktur eine periodische Organisation mit wohlgeordneter und hochsymmetrischer Struktur aufweist Muster.

Die konsistente Stabilität des Konsortiums wurde mithilfe von DGGE-Community-Profiling und 16 S ribosomalem RNA-Gen-Barcoding über einen Zeitraum von etwa drei Jahren Kultivierung (44 Transfers) in variablen Abständen von Monaten bewertet. Während dieses Zeitraums wurde die DNA des Konsortiums zu unterschiedlichen Zeitpunkten extrahiert (nach 5, 12, 16, 36 und 44 Transfers) und DGGE- und Illumina-Sequenzierung durchgeführt, um das Profil der Bakteriengemeinschaft basierend auf dem ribosomalen Gen zu vergleichen rrs. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Bakterienkern des Konsortiums trotz kleiner Schwankungen und Änderungen der Bandenintensitäten (auch nach Normalisierung) und der Bakterienzusammensetzung stabil blieb (ergänzende Abbildung 2A, B).

Nach 3 Jahren wurden >99,5 % der 1.032.456 metagenomischen Messwerte aus CNF taxonomisch zugeordnet. Die Ergebnisse zeigten, dass das Konsortium vier Bakterienarten umfasste (Abb. 3). Es gab keine Hinweise auf das Vorhandensein anderer Prokaryoten oder Pilze. Die am häufigsten im Metagenom des Konsortiums beobachteten Lesevorgänge (ungefähr 80 %) gehörten zu einem Actinobacterium, das als eng mit Carbonactinospora thermoautotrophica22 verwandt identifiziert wurde, gefolgt von einem mit Sphaerobacter spp. verwandten Chloroflexum. (9 % der Lesevorgänge), ein Proteobakterium (8 % der Lesevorgänge), das mit Chelatococcus spp. verwandt ist, und ein Firmicute (2 % der Lesevorgänge), das mit Geobacillus spp. verwandt ist. (Abb. 3a). Die Phylogenie des Barrnap-extrahierten Gens rrs ist in Abb. 3b dargestellt. Bemerkenswerterweise stimmten zwei verschiedene Contigs mit C. thermoautotrophica-Sequenzen überein, was darauf hinweist, dass dieser Stamm (C. thermoautotrophica St_consortium [StC]) zwei taxonomisch unabhängige rrs-Gene (StCopy1 und StCopy2) enthielt. Zwischen den rrs-Genen von C. thermoautotrophica StC wurde ein hoher Unterschied (>6 %) beobachtet.

a Taxonomische Zusammensetzung und b molekulare phylogenetische Analyse des Carbonitroflex-Konsortiums basierend auf den Genen rrs (16 S); Die Maximum-Likelihood-Methode und das Tamura-Nei-Distanzmodell57 wurden verwendet, um auf die Evolutionsgeschichte zu schließen. Der Baum mit der maximalen Log-Wahrscheinlichkeit wird angezeigt. Der Prozentsatz der Bootstrap-Bäume, in denen sich die zugehörigen Taxa auf diese Weise gruppieren, wird neben den Zweigen angezeigt. Die aus MAGs gefilterten RRS-Kopien werden mit einer Rautenform hervorgehoben. Die anfänglichen Bäume für die heuristische Suche wurden automatisch erhalten, indem die Neighbor-Joining- und BioNJ-Algorithmen auf eine Matrix geschätzter paarweiser Abstände unter Verwendung des Maximum-Composite-Likelihood-Ansatzes angewendet und die Topologie mit dem maximalen logarithmischen Likelihood-Wert ausgewählt wurden. Der Baum ist maßstabsgetreu gezeichnet, wobei die Astlängen proportional zum Tamura-Nei-Abstand sind. Die Analyse umfasste 32 Nukleotidsequenzen. Alle Positionen mit Lücken und fehlenden Daten wurden eliminiert. Evolutionäre Analysen wurden mit MEGA756 durchgeführt.

Tabelle 1 zeigt die CheckM-Ausgabe und gibt den Grad der Vollständigkeit der in Komplementationsanalysen verwendeten MAGs an. Alle MAGs zeigten eine Vollständigkeit von > 95 %. Es wurde ein Grenzwert von 1 % verwendet, was darauf hinweist, dass alle Messwerte, die zu einer anderen Art gehörten, <1 % der Gesamtwerte ausmachten. Dieser Befund wurde durch die Plattierung gestützt, bei der kein Wachstum beobachtet wurde. Unter Verwendung der BRIG- und DNAPlotter-Software und des BLASTN-Programms wurden die zu jedem Konsortiumsmitglied gehörenden Contigs in kreisförmiger Form dargestellt und dem Referenz-WGS zugeordnet (UBT1 und H1 für C. thermoautotrophica, DSM207045 für Sphaerobacter spp., DSM18167 für Chelatococcus spp. und DSM13240 für Geobacillus spp.) (Abb. 4a–c). Metagenomische Messwerte wurden auch für den zuvor isolierten und sequenzierten Geobacillus sp. kartiert (Abb. 3d). LEMMY01-Genom23 (Abb. 4d).

ein aus dem Carbonitroflex-Konsortium (Carbonactinospora thermoautotrophica St_consortium) und den Stämmen UBT1 und H1 isolierter Actinomycete; b Chelatococcus spp. Konsortiumsstamm und der Referenzstamm DMS18167; c Sphaerobacter thermophilus aus dem Konsortium und der Referenzstamm DSM20745; und d Geobacillus spp. Stamm LEMMY01 und der Referenzstamm DSM13240. Intensivere Farben stellen höhere BLASTN-Identitäten dar; Der GC-Gehalt ist in den inneren Kreisen angegeben.

Zur Isolierung der verschiedenen Mitglieder des CNF-Konsortiums wurden verschiedene feste Kulturmedien und die Loop-Depletion-Technik verwendet. Obwohl es sich im Konsortium um eine Minderheit (2 % der Lesevorgänge) handelt, sind Geobacillus spp. war das einzige Mitglied des Konsortiums, das isoliert werden konnte, da es leicht in R2A-Medium kultiviert werden konnte. Allerdings wurde in N-FIX kein Wachstum dieser Reinkultur erzielt. Sein Genom wurde zuvor von Ref. sequenziert. 23.

Enzyme, die für die aerobe Atmung von molekularem H2 und CO verantwortlich sind, wurden nur in drei Mitgliedern des Konsortiums kodiert: C. thermoautotrophica, Chelatococcus spp. und Sphaerobacter spp. C. thermoautotrophica besaß Hydrogenasen der Gruppen 1 und 2a, während Sphaerobacter spp. besaß diejenigen, die zur Gruppe 1 gehörten. Genauer gesagt, C. thermoautotrophica und Sphaerobacter spp. MAGs enthielten Gene, die für [NiFe]-Hydrogenasen der Gruppe 1 h (hhyL und hhyS) (Abb. 5, Ergänzende Daten 2) sowie für [MoCu]-Kohlenmonoxid-Dehydrogenasen vom Typ I (coxL, coxS und coxM) kodierten. darüber hinaus sind Chelatococcus spp. trotz der Abwesenheit von Hydrogenen vorhanden. enthielten auch Gene, die für Enzyme kodierten, die für die CO-Atmung erforderlich sind. Darüber hinaus wurden in Chelatococcus spp. keine CO2-Fixierungsgene nachgewiesen. und Sphaerobacter spp.

Stoffwechselmarker von Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel-, Sauerstoff- und Wasserstoffkreisläufen wurden über die HMM-Suche mit dem metabolisHMM-Tool identifiziert. Stoffwechselmarker mit * stehen für Gene mit hoher Homologie. (Siehe auch Zusatzdaten 2).

C. thermoautotrophica beherbergt Gene, die die Gewinnung von Energie aus CO- und/oder H2-Oxidation ermöglichen. Dieses Bakterium kann aerob wachsen, mit H2 oder CO als einziger Energie- und Elektronenquelle24; Es nutzt die aus der CO- und/oder H2-Oxidation gewonnene Energie, um sowohl die aerobe Atmung als auch die Kohlenstofffixierung im CBB-Zyklus zu unterstützen. Als einziges Mitglied, das Gene enthält, die die CO2-Fixierung unterstützen, schien C. thermoautotrophica StC für die Kohlenstofffixierung verantwortlich zu sein, da es das Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase-Enzym (RuBisCO) vom Typ IE enthielt, ein Mitglied der Calvin-Benson-Bassham-Gruppe (CBB)-Zyklus. Seine Schalen- und Hilfsenzyme wurden auch im StC-Genom gefunden, wie z. B. CcmL, das als Kohlendioxid-Konzentrationsmechanismus-Protein bezeichnet wird. Tatsächlich wurden Strukturen von bakteriellen Mikrokompartimenten (BMC-ähnlich), die mit Carboxysomen in Zusammenhang stehen, durch Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet (Abb. 2a, b). Die schnelle Fourier-Transformation, eine mathematische Darstellung der räumlichen Frequenzen des Bildes25, zeigte, dass die StC-Carboxysome eine periodische Organisation mit einem wohlgeordneten Muster aufweisen. Der Abstand zwischen den einzelnen Anordnungen beträgt zwischen 7 und 8 nm (Abb. 2c).

In Bezug auf den Stickstoffkreislauf zeigten die KEGG Pathway-Datenbank und die MEGAN5-Software, dass keiner der aus den Metagenomen erhaltenen Messwerte mit zuvor charakterisierten Nitrogenase-kodierenden Genen wie nifD (Nitrogenase-Molybdän-Eisen-Protein-Alpha-Kette [EC:1.18.6.1]) in Zusammenhang stand. ), nifH (Nitrogenase-Eisen-Protein) und nifK (Nitrogenase-Molybdän-Eisen-Protein-Betakette [EC:1.18.6.1])26. Darüber hinaus lieferte die PCR-Amplifikation mit degenerierten nifH-Primern negative Ergebnisse in der metagenomischen DNA, obwohl für H. seropedicae (Positivkontrolle) positive Ergebnisse erzielt wurden.

C. thermoautotrophica StC beherbergte die nirBD-Gene, die für Nitritreduktase in Bakterien kodieren; inzwischen ist die Sphaerobacter spp. MAG enthielt denitrifizierende Gene, die mit der N2O-Reduktion (nos-Gen, das eine Multikupfer-N2O-Reduktase kodiert, die mit der Reduktion von N2O zu N2 verbunden ist) und Denitrifikation (nirK-Gen, das eine periplasmatische kupferhaltige Nitritreduktase kodiert, die an der Reduktion von NO2− zu NO beteiligt ist) zusammenhängen.

Stickstoffmarkierte Tests wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob das Wachstum des CNF-Konsortiums unabhängig von exogenem kombiniertem Stickstoff war. Der Einsatz eines 15N2-Isotopentracers zeigte im CNF-Konsortium keine Anreicherung von 15N. Nur die Positivkontrolle (H. seropedicae) baute unter den Testbedingungen 15N2 in die Biomasse ein. Im stickstofffreien Medium wurde kein Wachstum von E. coli oder keine Inokulation (Negativkontrollen) beobachtet (Tabelle 2).

Die kombinierte metabolische Vielseitigkeit der Kohlenstoff-, Stickstoff- und Schwefelwege und Gene, die mit dem Sauerstoff- und Wasserstoffstoffwechsel im CNF-Konsortium verbunden sind, sortiert nach MAG, ist in Abb. 5 dargestellt (siehe auch Ergänzende Daten 2). Insgesamt kann die Kohlenstofffixierung durch C. thermoautotrophica StC durchgeführt werden, das zusätzlich zu coxL, coxM und coxL, die für CO-Dehydrogenase und Formiatoxidase kodieren, Gene enthält, die für RuBisCO-Enzyme kodieren; Darüber hinaus besitzt es fdhA, fdhB und fdhC, die für Formiatdehydrogenasen kodieren, die offenbar an den katalytischen Funktionen von CO-Dehydrogenase und Formiatoxidase beteiligt sind. Darüber hinaus besaß C. thermoautotrophica StC, wie oben erwähnt, [NiFe]-Hydrogenasen der Gruppen 1 und 2a. Die Funktionalität wurde in diesem Fall auf der Grundlage der Homologie abgeleitet; Daher müssen diese funktionellen Zuordnungen in zukünftigen Studien bestätigt werden.

In Übereinstimmung mit den PCR-Daten konnte das Vorhandensein von Stickstofffixierungswegen nicht festgestellt werden. Bemerkenswerterweise umfasste die mit dem Stickstoffkreislauf verbundene Funktion im CNF-Konsortium die Denitrifikation bei Sphaerobacter spp. MAG unter Verwendung von N2O-Reduktase (kodiert durch nosZ und nosD) und Nitritreduktase (kodiert durch nirK und nirD) und in C. thermoautotrophica StC MAG unter Verwendung der Enzyme, kodiert durch nirB und nirD (verantwortlich für die Reduktion von Nitrit zu NH4 über einen Assimilationsweg) . Diese Daten legen nahe, dass NO2 durch Nitritreduktion Stickstoff produziert, möglicherweise in Form von NH4, der dann weiter in Glutamat eingebaut wird. Das Vorhandensein von Proteinen, die an der Nitrifikation beteiligt sind, wurde in den MAGs eines Konsortiumsmitglieds nicht vorhergesagt. Teilweise und/oder vollständige offene Leserahmen für alle wichtigen orthologen Proteine, die an der Denitrifikation beteiligt sind, wurden in den MAGs von Sphaerobacter spp. vorhergesagt. und Chelatococcus spp. Allerdings fehlten in beiden Metagenomen entscheidende Protein-kodierende Gene, die für die endgültige Reduktion von NO zu N2 erforderlich sind, was zu einer unvollständigen Kartierung der Denitrifikation führte.

Eine mögliche Erklärung für die verschiedenen Stoffwechselwege, die die Wechselwirkungen des Konsortiums antreiben, ist in Abb. 6 dargestellt. Wir vermuten, dass C. thermoautotrophica StC der Hauptakteur bei der Aufrechterhaltung lebensfähiger CNF unter extremen thermophilen und oligotrophen Bedingungen ist. Daher wurde eine Vereinbarung namens Ernährerhypothese vorgeschlagen, um die Beziehung zwischen den Mitgliedern dieses Modellkonsortiums zu erklären. Das Konzept wird weiter unten besprochen.

Die Hauptenergie und die Kohlenstoffbindung werden von Carbonactinospora thermoautotrophica StC (dem Ernährer und einzigen Mitglied, das zur Kohlenstofffixierung fähig ist) bereitgestellt, während der in das Konsortium integrierte feste Kohlenstoff von Sphaerobacter thermophilus, Chelatococcus spp. und Geobacillus spp. genutzt wird.

Die lange Geschichte der wiederholten Grasverbrennung von Pflanzenmaterial hat möglicherweise die Auswahl thermophiler carboxydotropher Bakterien erleichtert, die die einzigartigen Stoffwechselvorgänge umfassen, die in unserem CNF-Konsortium beobachtet wurden. Mehrere Quellen, darunter die Verbrennung von Biomasse, sind für die Emission von CO, CO2, H2, NOx, N2O und NH327 verantwortlich, was möglicherweise dazu beigetragen hat, dass Mikroorganismen, die ohne organische Kohlenstoff- und Stickstoffquellen wachsen können, durch den Verbrauch gasförmiger Atmosphäre wachsen können ( CO, N2 und O2). Die während des Kontinuumsreplikationsprozesses (>3 Jahre) beobachtete Persistenz der weniger häufig vorkommenden Taxa deutete darauf hin, dass die Organismen entweder den Stoffwechsel des anderen ergänzen oder von den Sekundärmetaboliten verschiedener Akteure profitieren.

Die mikroskopische Analyse ergab, dass dieses Konsortium aus grampositiven filamentösen Bakterien mit Sporen bestand, die mit einer kleinen Anzahl von Kokken und Bazillen assoziiert waren. Es wurden keine anderen Mikroben nachgewiesen und es wurden keine Pilzmyzelien festgestellt. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass der filamentöse StC-Bakterienstamm im Konsortium Carboxysomen-ähnliche Strukturen enthält. Carboxysome sind eine Familie von BMCs, die in Cyanobakterien und einigen Proteobakterien vorkommen und das primäre CO2-fixierende Enzym RuBisCO in einer virusähnlichen polyedrischen Proteinhülle einkapseln21. Dies weist auf einen Grad der Kompartimentierung der Kohlenstofffixierung im CNF-Konsortium hin.

Zusätzlich zu den physiologischen und morphologischen Untersuchungen bestätigten MAG- und Genomdaten das Vorhandensein von Carboxysomengenen in C. thermoautotrophica StC. Obwohl es sich um ein seltenes Phänomen handelt, wurde der große Unterschied (>6 %) zwischen den rrs-Kopien in C. thermoautotrophica StC auch bei anderen Actinobakterien berichtet und unterstützt unsere taxonomische Identifizierung, da dies ein gemeinsames Merkmal von C. thermoautotrophica ist22,24.

Die anderen in der Bakterienkultur vorhandenen Mitglieder waren taxonomisch mit Chelatococcus spp., Geobacillus spp. und Sphaerobacter spp. verwandt, bei denen es sich um Bakteriengattungen handelt, von denen bekannt ist, dass sie thermophile Arten enthalten18.

Nach phylogenetischer Analyse wurde das Stoffwechselpotenzial der Konsortiumsmitglieder untersucht. Alle vier Organismen trugen Gene, die für Proteine kodierten, die die aerobe Atmung erleichterten; Dieser Befund stimmte mit den Ergebnissen überein, die unter unseren experimentell geschaffenen belüfteten Wachstumsbedingungen erzielt wurden. Mittlerweile wurden Gene, die für die Oxidation von organischem Kohlenstoff (heterotropher Stoffwechsel) erforderlich sind, nur in Sphaerobacter spp., Chelatococcus spp. und Geobacillus spp. nachgewiesen. Die in C. thermoautotrophica StC identifizierten hochaffinen Abstammungslinien unterstützen seine Fähigkeit, H2 und CO, die in Spurenkonzentrationen in der Atmosphäre vorhanden sind, abzufangen. Darüber hinaus enthielt C. thermoautotrophica StC MAG genetische Informationen, die für die Carboxydotrophie (coxS, coxM und coxL) und die Autotrophie durch RuBisCO vom Typ IE erforderlich sind, das Mitglied des CBB-Zyklus ist. Obwohl bei Chelatococcus spp. keine Gene im Zusammenhang mit der CO2-Fixierung nachgewiesen wurden. und Sphaerobacter spp. verfügten sie über vollständige Wege zur Oxidation von CO und konnten aus diesem Spurengas Energie gewinnen. Insbesondere wurde die Expression der Hydrogenase der Gruppe 1 in C. thermoautotrophica StC und Sphaerobacter spp. nachgewiesen. und die in C. thermoautotrophica StC nachgewiesene Gruppe 2a könnte die Nutzung von H2, einem weiteren Spurengas, als Energiequelle durch diese Mikroben erleichtern. Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass C. thermoautotrophica StC das mikrobielle Konsortium hauptsächlich durch Kohlenstofffixierung mit Kohlenstoff versorgt. Die Energie für das System wird von C. thermoautotrophica StC, Chelatococcus spp. und Sphaerobacter spp. bereitgestellt, da sie offenbar in der Lage sind, CO als Energiequelle zu nutzen. Die metabolische Kompartimentierung dieser Arten sowie die Unfähigkeit, einzelne Komponenten unter ihnen zu isolieren, weisen auf ein gewisses Maß an gegenseitiger Abhängigkeit (zumindest bei einigen Mitgliedern) und Zusammenarbeit zwischen den Taxa hin, wohingegen Geobacillus spp. profitiert wahrscheinlich von organischen Verbindungen, die von den anderen Mitgliedern in solchen oligotrophen Systemen produziert werden.

Was die Stickstoffaufnahme betrifft, weisen alkalische Böden, wie der Boden, aus dem wir unsere Proben gewonnen haben, tendenziell eine höhere Verfügbarkeit von Ammoniak28 auf, das für CNF-Mitglieder in ihrer natürlichen Umgebung eine Stickstoffquelle sein könnte. Dennoch kann das Konsortium für ein langfristiges Überleben unter äußerst widrigen Bedingungen wie unserem N-FIX-Medium auf die Stickstofffixierung und/oder eine hohe Stickstofffangkapazität eines oder mehrerer Mitglieder des Konsortiums angewiesen sein, die in der Lage sind, Spurenmengen zu verwerten von NH3. In der vorliegenden Studie zeigte das Konsortium aus vier Stämmen jedoch keine klassischen Nitrogenase-kodierenden Gene. Darüber hinaus konnten wir im Versuchsaufbau mit dem Isotopentracer (15N2) keine Stickstofffixierungsaktivität feststellen. Es wurden keine Hinweise auf eine (klassische) N2-Fixierung beobachtet; Daher legt die Fähigkeit dieses Konsortiums, im N-FIX-Medium zu wachsen, die Existenz eines effizienten Mechanismus zur Gewinnung von Stickstoff für die Biomasseerzeugung nahe.

Die Möglichkeit, dass das Gasgemisch mit Spuren von NH4 verunreinigt war (trotz der vom Unternehmen garantierten Reinheit von 99 %), konnte nicht vollständig ausgeschlossen werden. Darüber hinaus könnten im Medium Spurenverunreinigungen aus der Luft vorhanden sein, da sich NH3 in Wasser extrem schnell auflöst.

Yoshida et al.29 berichteten, dass Rhodococcus erythropolis N9T-4, ein extrem oligotrophes Actinomyceten-Isolat, in Minimalmedium ohne Stickstoffquelle wachsen kann. Die Stickstoffoligotrophie von N9T-4 beinhaltet die starke Expression eines Ammoniumtransportergens (amtB); Die Autoren schlugen vor, dass N9T-4 Spuren von atmosphärischem Ammoniak als Stickstoffquelle nutzen kann. Daher ist das Abfangen von Stickstoff eine weitere sparsame Erklärung für das Wachstum von Mikroben, da es bereits bei anderen Mikroben nachgewiesen wurde, die in einem stickstofffreien Medium überleben24,29. Das Vorhandensein von Super-Scavenger-Bakterien, die unter solchen Bedingungen gedeihen können, dürfte jedoch das Wachstum der Mitglieder des gesamten Konsortiums wahrscheinlich nicht erklären. Darüber hinaus hemmte die Verwendung von Klinoptilolith (einem starken Chelator für Spuren von Ammoniak) und Noble-Agar das Wachstum des Konsortiums nicht. Obwohl das Abfangen von Stickstoff aufgrund des hypothetischen Vorhandenseins unbekannter Stoffwechselwege (z. B. die jüngste Beschreibung eines neuen Mechanismus zur biologischen Stickstofffixierung in Lit. 30) nicht vollständig ausgeschlossen werden kann, glauben wir, dass dies bei den in der vorliegenden Studie angewandten strengen Maßnahmen der Fall wäre erzeugen möglicherweise nicht genügend Stickstoff (falls vorhanden), um das Bakterienwachstum zu unterstützen, und würden somit nur das Wachstum echter Diazotrophen auf dem N-FIX-Medium fördern.

Das Fehlen eines klassischen Stickstofffixierungswegs wirft Fragen hinsichtlich des strengen Stickstoffhaushalts in dieser extrem rauen oligotrophen Umgebung und der Notwendigkeit auf, dass die dort lebenden Extremophilen unter Stickstoffknappheit wachsen. Eines der Hauptanliegen der aktuellen Studie war das Wachstum des Konsortiums ohne eine reduzierte Stickstoffquelle (NH3 oder organischer Stickstoff). Theoretisch könnte eine Nekromasse oder ein viraler Shunt ein minimales Wachstum aufrechterhalten31. Tatsächlich zeigten Shoemaker et al.32, dass bei geschlossenen Systemen das Nekromasse-Recycling zur Aufrechterhaltung energiebegrenzter Zellen beitrug und auch die Reproduktion einigermaßen erleichterte. Es erscheint jedoch höchst unvernünftig, das Wachstum des Konsortiums nur mit einem viralen Shunt, Kannibalismus oder der Verwendung von Nekromassen zu erklären. Daher schlagen wir vor, dass das Konsortium N2 über einen unbekannten Mechanismus fixierte oder dass mindestens ein äußerst effizienter Fänger im Konsortium vorhanden war, der für die erhöhte Biomasse aller Mitglieder verantwortlich war und möglicherweise Nekromasse oder organische Verbindungen (einschließlich Stickstoffquellen) für die anderen bereitstellte.

Darüber hinaus konnte das Vorhandensein von Proteinen, die an der Nitrifikation beteiligt sind, nicht vorhergesagt werden. Darüber hinaus sind die Metagenome von Sphaerobacter spp. und Chelatococcus spp. wiesen einen Mangel an entscheidenden Genen auf, die für Proteine kodieren, die an der endgültigen Reduktion von NO zu N2 beteiligt sind; Dies führte zu einer unvollständigen Kartierung der Denitrifikation. Allerdings sind unvollständige Denitrifikationswege bei Extremophilen, insbesondere bei Thermophilen, häufig33. Typischerweise erfordert die Denitrifikation niedrige Sauerstoffwerte und hohe Nitratwerte, die sich von den Wachstumsbedingungen in der vorliegenden Studie unterscheiden.

Aus dem Konsortium sind nur Geobacillus spp. (LEMMY01) konnte mithilfe eines nährstoffarmen Reasoner's 2 A-Mediums (R2A) isoliert werden, das zu den Medien gehört, die am häufigsten für die Isolierung und das Wachstum von oligotrophen Umweltbakterien verwendet werden. Allerdings war derselbe Stamm nicht in der Lage, in einem N-FIX-Medium mit einer Gasatmosphäre axenisch zu wachsen. Trotz zahlreicher Versuche mit verschiedenen Wachstumsbedingungen und Medien konnten Sphaerobacter spp., Chelatococcus spp. und C. thermoautotrophica StC weder in einem nährstoffreichen noch in einem nährstoffarmen Wachstumsmedium isoliert werden.

Das thermophile, autotrophe und aerobe Bakterienkonsortium CNF wächst seit drei Jahren unter rauen Bedingungen (nährstoffarme Umgebung mit Spurengasatmosphäre), was stark auf das Auftreten einer Kohlenstoff- und Stickstofffixierung hindeutet. Insgesamt deuten die metagenomischen Daten darauf hin, dass das CNF-Konsortium atmosphärisches H2, CO2 und CO für Energie- und Kohlenstoffquellen abfangen kann und dass C. thermoautotrophica StC in erster Linie für die Bereitstellung von Kohlenstoff in der Biomasse des Konsortiums durch CO2-Fixierung verantwortlich ist. Darüber hinaus ist C. thermoautotrophica StC zusammen mit Chelatococcus spp. und Sphaerobacter spp. besitzen die Fähigkeit, durch Oxidation atmosphärischer Spurengase (H2 und/oder CO) Energie zu gewinnen und/oder zu sparen. In Übereinstimmung mit diesen Erkenntnissen haben Reinkulturexperimente gezeigt, dass das Abfangen von Spurengasen das Fortbestehen verschiedener heterotropher Aerobier unter Bedingungen eines Mangels an organischem Kohlenstoff ermöglicht34.

Positive Interaktionen gelten typischerweise als selten. Dennoch sind die Häufigkeit positiver Interaktionen und die Bedingungen, unter denen sie auftreten, nicht klar geklärt. Kehe et al.35 versuchten, dieses Thema mithilfe von kChip, einer Ultrahochdurchsatz-Kokulturplattform, anzugehen, um 180.408 Interaktionen zwischen 20 Bodenbakterien in 40 Kohlenstoffumgebungen zu messen. Sie beobachteten, dass positive Wechselwirkungen, die oft als selten beschrieben werden, häufig und hauptsächlich als Parasitismus zwischen Stämmen mit unterschiedlichen Kohlenstoffverbrauchsprofilen auftraten.

Insgesamt deuten die in der vorliegenden Studie gewonnenen Daten darauf hin, dass C. thermoautotrophica eine Schlüsselart in diesem Modellökosystem war. Das aus vier Arten bestehende Konsortium in dieser Studie, das das extrem oligotrophe Ökosystem repräsentiert, kann für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Bakterien und des Mikrobiomaufbaus unter solch extremen Bedingungen nützlich sein. Obwohl die Kohlenstofffixierung nachgewiesen und die Schlüsselarten in diesem Konsortium identifiziert werden konnten, verfügte das Konsortium über einen intrinsischen, aber unklaren Stickstoffassimilationsmechanismus. Die Fähigkeit dieser Mikroorganismen, in diesem Medium unter Verwendung von Stickstoff aus der Luft zu wachsen und zu gedeihen, legte die Existenz einer hocheffizienten Strategie zur Nutzung dieses Nährstoffs nahe.

Insgesamt wurde davon ausgegangen, dass die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur des CNF durch die Selektion von Bakterien geprägt wird, die unter diesen physikalisch extremen, chemisch entzogenen Wachstumsbedingungen überleben können. Daher schlagen wir die Ernährerhypothese vor, um die Funktionsweise und Interaktionen dieses Modellkonsortiums für mikrobielle Zusammenarbeit und Kohlenstofffixierung unter strengen oligotrophen Bedingungen zu erklären. Dieser in den Sozialwissenschaften verwendete Begriff bezieht sich auf eine Person, die Geld verdient, um ihre Familie zu ernähren36. In unserem Konsortium ist C. thermoautotrophica StC der Ernährer, der für das Überleben aller Konsortiumsmitglieder wichtig ist, und das einzige Mitglied, das unter diesen Wachstumsbedingungen metabolisch aktiv bleiben kann. C. thermoautotrophica StC ist das einzige Mitglied, das Gene für einen bekannten Kohlenstofffixierungsweg aufweist. In diesem Zusammenhang bindet C. thermoautotrophica StC Kohlenstoff und ermöglicht so den Einbau dieses Elements in das System, das für das Überleben anderer Mitglieder unerlässlich ist.

Der Verlust von C. thermoautotrophica StC wäre für die anderen Mitglieder dieses Konsortiums fatal. Die anderen Mitglieder wären die sogenannten Begünstigten, bei denen Chelatococcus spp. und Sphaerobacter spp. wären die Mitarbeiter (Mitglieder, die nicht unbedingt erforderlich sind, aber der Gruppe einige Vorteile bieten) und Geobacillus spp. wäre ein Opportunist oder Betrüger, zumindest angesichts der verfügbaren Daten und des Energiebedarfs.

Weitere Studien mit Genexpressionsassays sind erforderlich, um Genexpression und Metabolomik sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von Stickstoff zu vergleichen und die Mechanismen aufzuklären, die dem Überleben dieses Konsortiums zugrunde liegen. Trotz der Hinweise auf unvollständige Stickstoffassimilationswege können wir die Möglichkeit der Existenz weiterer Ernährer im Konsortium nicht ausschließen. Der Mechanismus der Stickstoffassimilation ist noch unklar und könnte eine Schlüsselkomponente im Zusammenhang mit bestimmten Mitgliedern des Konsortiums sein. Daher ist die Isolierung weiterer Mitglieder des Konsortiums neben Geobacillus sp. (zum Beispiel die Verwendung spezifischer Antibiotika und Kulturbedingungen, basierend auf den von den MAGs erhaltenen Daten) kann nützlich sein, um Schlüsselmechanismen über In-vitro-Assays aufzuklären; Im Vergleich zu Vorhersagen anhand metagenomischer Daten sind solche Tests stabiler und ermöglichen die genauere Untersuchung biochemischer Funktionen. Beispielsweise weisen mehrere Apoenzyme, die am Kohlenstoff- und Stickstoffstoffwechsel beteiligt sind, posttranslationale Modifikationen und Cofaktor-Reifung auf (wie Molybdopterin und Fe-Häm)37. Die Isolierung der Hauptkomponente, C. thermoautotrophica StC, würde es uns auch ermöglichen, Stoffwechselwege in natürlichen und konstruierten mikrobiellen Systemen mithilfe systemischer Ansätze und synthetischer Biologie zu untersuchen, zu modellieren, zu manipulieren und zu entwerfen. Wir können jedoch feststellen, dass alle Begünstigten vollständig von der Energie abhängig sind, die vom Ernährer C. thermoautotrophica StC bereitgestellt wird, wohingegen der Beitrag anderer Mitglieder zur Effizienz des Überlebens des Konsortiums in einem derart nährstoffarmen Medium beitragen könnte.

Unsere Daten bieten Einblicke in einige der grundlegenden Themen der Umweltmikrobiologie, wie z. B. die Kultivierungsfähigkeit von Mikroben38,39, und sollten zur Unterstützung anderer Studien nützlich sein, die ökologische Wechselwirkungen und biotechnologische Anwendungen mikrobieller Extremophiler untersuchen.

Insgesamt wurden fünf Proben aus lehmigem Sandboden (0–5 cm Schicht) unter einem Haufen verbrannten Grases mit einer langen Verbrennungsgeschichte in der Gemeinde Seropédica, Rio de Janeiro, Brasilien (22°46'34,59 Zoll S 43) entnommen °41'30,71" W). Es wurde angenommen, dass die von der Oberfläche (0–5 cm) entnommene Bodenprobe stärker Hitze und höheren Konzentrationen von Gasen ausgesetzt war, darunter CO, CO2, H2, Stickoxid (NOx), Lachgas (N2O) und NH340. aufgrund von Vegetationsverbrennungen27. Der Boden wurde mit Spateln gesammelt, die mit 70 % Ethanol desinfiziert wurden. Gemäß der brasilianischen Gesetzgebung zum Zugang zur biologischen Vielfalt (Gesetz 13.123/15 und Dekret 8.772/16) haben wir die entsprechende Genehmigung von SisGen (Nationales System für die Verwaltung des genetischen Erbes und des damit verbundenen traditionellen Wissens; Sammlungslizenznummer: AC72B83) eingeholt. Bei der Probenahmestelle handelte es sich um ein offenes Feld, auf dem organische Pflanzenreste wie Baumschnitte und Gras routinemäßig entsorgt und >15 Jahre lang verbrannt wurden (ergänzende Abbildung 1A, B). Die Bodenproben wurden sofort zum Molecular Microbial Ecology Laboratory (LEMM) der Bundesuniversität Rio de Janeiro (UFRJ) in Rio de Janeiro, Brasilien, transportiert. Eine Kontrollbodenprobe wurde an einem nahegelegenen Standort entnommen, an dem es in der Vergangenheit keine Brände gab. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften aller Bodenproben wurden in dreifacher Ausfertigung unter Verwendung von Standardlaborprotokollen41,42 bestimmt.

Aliquots von 0,5 g jeder Bodenprobe wurden in 100-ml-Fläschchen geimpft, die 40 ml Mineralmedium für Autotrophe43, ergänzt mit einem Spurenelement, einer Vitaminlösung und 4 mM NH4Cl44, enthielten. Das NH4Cl wurde nur für die erste Anreicherungsrunde hinzugefügt. Das mit Erde beimpfte Medium wurde bei 55 °C inkubiert, bis mikrobielles Wachstum beobachtet wurde. Nach dem Auftreten von mikrobiellem Wachstum im Medium wurden die Kolonien, die als weiße schwimmende Häutchen sichtbar waren, in einen anderen Kolben mit 40 ml eines stickstofffreien Mediums (N-FIX) überführt45. Zur Herstellung von N-FIX wird Lösung A mit 0,3 g MgSO4·7H2O, 0,2 g NaCl, 0,1 g CaCl2·2H2O und 12,6 mg Na2MoO4·2H2O, ergänzt mit 2 ml einer Spurenelementlösung (100 mg/L ZnSO4·7H2O, 30 mg/L MnCl2·4H2O, 300 mg/L H3BO3, 200 mg/L CoCl2·6H2O, 10 mg/L CuCl2·2H2O, 20 mg/L NiCl2·6H2O, 900 mg/L Na2MoO4·2H2O und 20 mg/L L Na2SeO3)44 und Lösung B, eine Pufferlösung (0,9 g/L K2HPO4 + 0,1 g/L KH2PO4), wurden jeweils im Verhältnis 3:1 gemischt. Das Medium wurde auf pH 7,2 eingestellt. Die Kulturen wurden im N-FIX-Medium gehalten und schwimmende Häutchen wurden einzeln in Fläschchen mit 40 ml frischem N-FIX-Medium überführt, wobei eine Platinschleife in einem Laminar-Flow-Schrank verwendet wurde. Die 100-ml-Fläschchen (enthalten 40 ml des Mediums) wurden mit einer Gummikappe und einer Aluminiumdichtung hermetisch verschlossen, und der Kopfraum wurde mit synthetischer Luft (80 % N2 + 20 % O2), CO und CO2 in einem Verhältnis von gefüllt 50/45/5. Die aufgetragene Gaslösung wurde zuvor mit einer sterilen Spritze aus Kanistern gesammelt und in Millipore-Spritzenfiltern (0,2 µm) filtriert. Während des gesamten Prozesses wurden sterile Nadeln verwendet. Anschließend wurden die Proben einen Monat lang statisch bei 55 °C inkubiert46. Nicht beimpfte Fläschchen wurden als Negativkontrolle für alle Impfungen und Transfers aufbewahrt.

Die Kolonien starben oder sporulierten nach > 1 Monat Inkubationszeit; Darüber hinaus konnten wir die Glycerinvorräte nach dem Einfrieren bei Temperaturen von –80 °C und –20 °C nicht wiederbeleben. Die Zellkulturen im N-FIX-Medium wurden in einem Ofen bei 55 °C gehalten und alle 2 Wochen mit frischem Medium neu beimpft. Von den ursprünglichen Bodenproben wurde mikrobielles Wachstum nur in drei Flaschen beobachtet, die das mineralische Bodenmedium für Autotrophen43 enthielten, und nur in einem Kolben, der das N-FIX-Medium enthielt. Die Kulturen, die Wachstum zeigten, wurden dann einzeln in mehreren Kolben repliziert und mindestens drei Replikate wurden für die Dauer des Experiments am Leben gehalten. Die Kontrollbodenproben zeigten während derselben Inkubationszeit kein mikrobielles Wachstum. Für nachfolgende Analysen wurden die Replikate kombiniert, um die Biomassegewinnung zu verbessern.

Um die Fähigkeit von CNF zu bestimmen, unter stark restriktiven Bedingungen ohne Spuren von kontaminierendem Ammonium zu wachsen, wurde das N-FIX-Medium mit 1,5 % hochreinem Noble-Agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) verfestigt und mit modifiziert 0,3 % Klinoptilolith (ein ammoniakabfangender Zeolith)47,48. Zur Isolierung der Konsortiumsmitglieder wurde ein Satz verschiedener Kulturmedien verwendet, bestehend aus verfestigtem N-FIX45, Reasoner's 2 A-Agar (R2A) (DSMZ-Medium 830), Trypticase-Soja-Agar (DSMZ-Medium 1617) und Luria-Bertani-Brühe (DSMZ-Medium 381). ), JNFb-Brühe1 oder Super-Optimal-Brühe mit Katabolitenrepression (SOC)49 wurden mit Inkubation bei verschiedenen Temperaturen (28 °C, 37 °C oder 55 °C) für 15 Tage verwendet.

Ein Phasenkontrastmikroskop (Zeiss AxioPlan 2) wurde verwendet, um das Kulturwachstum 3, 7 und 15 Tage nach der Inokulation zu überwachen. Aliquote des nicht beimpften N-FIX-Mediums wurden auf das Vorhandensein von Zellen analysiert. Am Nationalen Zentrum für Strukturbiologie und Bioimaging wurde ein FEI Morgagni-Mikroskop (Thermo Fisher Scientific) für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und ein FEI Quanta 250 Rasterelektronenmikroskop (FEI, Niederlande) für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) verwendet , UFRJ. Die Proben wurden mindestens zweimal in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) gewaschen, um alle nicht anhaftenden Bakterien aus dem filamentösen Wachstum zu entfernen, und dann 1 Stunde lang in 2,5 % Glutaraldehyd und 4 % Formaldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer fixiert bei Raumtemperatur (ca. 22 °C). Anschließend wurden die Proben im gleichen Puffer gewaschen, 2 Stunden lang in 1 % Osmiumtetroxid (OsO4) und 1,25 % Kaliumferrocyanid nachfixiert und dann in einer Reihe steigender Ethanolkonzentrationen (30 %, 50 %, 70 %) dehydriert. , 90 %, 100 % und ultratrockenes Ethanol) für 30 Minuten bei jedem Dehydrierungsschritt. Für die SEM wurden die Proben in CO2 am kritischen Punkt getrocknet, mit Gold beschichtet und mit dem FEI Quanta 250-Mikroskop beobachtet. Für TEM wurden dehydrierte Proben langsam in Spurr-Harz (Electron Microscopy Sciences, USA) eingebettet. Ultradünne Schnitte der Proben wurden mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und Bilder wurden mit einem FEI Spirit Transmissionselektronenmikroskop aufgenommen. Alle Bilder wurden mit der Software Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems Co., USA) verarbeitet. Die Fast-Fourier-Transformation (FFT), eine mathematische Darstellung der räumlichen Frequenzen des Bildes25, und Messungen (Ergänzungsdaten 1) wurden mit der Digital Micrograph-Software (Gatan, Inc.) durchgeführt.

Für die Community-Analyse (Amplikon-Metabarcoding und Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) wurde die Gesamt-DNA sowohl der ursprünglichen Konsortien als auch der Konsortien, die nach bestimmten Zeitpunkten nach seriellen Transfers in N-FIX-Medium erhalten wurden, mit einem FastDNA™ SPIN Kit for Soil (MP) analysiert Biomedizin) gemäß dem Standardprotokoll. Für die metagenomische Analyse wurde eine Konsortialprobe, die nach 10 Transfers über das N-FIX-Medium erhalten wurde, zur DNA-Extraktion verwendet. Um die Zellrückgewinnung zu verbessern, wurde 1 ml einer 10 %igen (Volumen/Masse etwa 0,03 M) Natriumdodecylsulfatlösung in jeden Kolben mit Kulturmedium gegeben, mit einer Endkonzentration von etwa 0,25 % (0,0008 M). Der Inhalt von drei Glasflaschen (120 ml), die die ausgewachsenen Konsortien enthielten, wurde durch sterile 0,22-µm-Millipore-Membranen filtriert; Die Membranen wurden dann direkt einer DNA-Extraktion unterzogen, und anstelle des einzelnen Lyseschritts im FastPrep™-System (Bio 101, Inc., La Jolla, CA, USA) führten wir den Lyseschritt erneut durch. Wir verwendeten das FastPrep™-System 40 s lang bei 6,0 U/min. Nanodrop™ und Qubit™ (Thermo Fisher Scientific) wurden verwendet, um die Qualität (Verhältnisse 260/230 und 260/280) bzw. die Menge der extrahierten DNA zu bewerten. Die Elektrophorese wurde unter Verwendung von 1,0 % Agarosegel für 40 Minuten bei 90 V durchgeführt, anschließend wurden die Gele mit SYBR™ Safe (Thermo Fisher Scientific) gefärbt und unter einem Ultraviolett-(UV)-Transilluminator beobachtet, um die DNA-Integrität zu beurteilen.

Das Vorhandensein von Stickstofffixierungssystemen in den Konsortien wurde mittels PCR durch gezieltes Targeting des nifH bestimmt, einem Gen, das die Dinitrogenase-Reduktase-Untereinheit des Nitrogenase-Enzyms kodiert, das ein biologischer Marker für die Stickstofffixierung ist50. Die Primer PolF und PolR51 wurden gemäß dem folgenden Protokoll verwendet: anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 1 Minute, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 1 Minute, Annealing bei 55 °C für 1 Minute, Verlängerung bei 72 °C C für 2 Minuten und abschließende Amplifikation bei 72 °C für 5 Minuten. Herbaspirillum seropedicae ATCC 35892 und Escherichia coli BL21 wurden als Positiv- bzw. Negativkontrollen in JNFb- bzw. SOC-Medien verwendet1. Die Elektrophorese der Amplifikate wurde auf 1,5 %igen Gelen für 40 Minuten bei 100 V durchgeführt. Anschließend wurden die Amplifikate mit SYBR Safe angefärbt und unter einem UV-Transilluminator beobachtet.

Die PCR-Amplifikation der extrahierten DNA wurde unter Verwendung der Primer U968-gc (5ʹ-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3ʹ) und L1401 (5ʹ-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG −3ʹ) durchgeführt. Eine hypervariable Region des Gens rrs wurde amplifiziert und eine Genkodierung der ribosomalen RNA, aus der die kleine Untereinheit des bakteriellen Ribosoms (16 S) besteht, wurde durchgeführt52. Die Amplifikationsreaktion wurde wie von Machado de Oliveira et al.53 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse der Amplifikationsreaktion wurden durch Elektrophorese von Proben auf 1,5 % Agarosegel bei 100 V für 40 Minuten bestimmt. Das Gel wurde mit SYBR Safe gefärbt und unter einem UV-Licht-Transilluminator beobachtet. DGGE wurde unter Verwendung des DCode™-Systems (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) bei 70 V und 65 °C für 16 Stunden durchgeführt. Das Denaturierungsgradientengel wurde mit einer peristaltischen Pumpe und einem Gradientengeneratorblock hergestellt. Der Gradient der Denaturierungsmittel Harnstoff und Formamid lag im Bereich von 35–65 %, und das Gel enthielt 6 % Polyacrylamid. Die Gele wurden 20 Minuten lang mit SYBR Safe gefärbt und mit einem Storm®-Gelscanner (General Electric) beobachtet. Bevor die PCR-Produkte auf das DGGE-Gel aufgetragen wurden, wurden sie quantifiziert und normalisiert, um sicherzustellen, dass alle Änderungen der Bandenintensitäten die Änderungen ihrer relativen Häufigkeit widerspiegelten.

Die aus der seriellen Übertragung in N-FIX erhaltene DNA wurde auch zur Amplifikation der hypervariablen Regionen V5 und V6 des bakteriellen 16 S-rRNA-Gens (gemäß Lit. 16) am Argonne National Laboratory (http://ngs.igsb) verwendet .anl.gov, Lemont, IL, USA) durch den Next Generation Sequencing Core auf einem Illumina MiSeq System (Illumina, San Diego, CA, USA) gemäß den Richtlinien des Herstellers. Die mikrobiellen Daten wurden auch nach Santoro et al.16 analysiert. Die Daten wurden mit Links zur BioProject-Zugangsnummer PRJNA373874 in der DDBJ-BioProject-Datenbank hinterlegt: zusammen mit den Zugangsnummern SAMN33200710, SAMN33200711, SAMN33200712, SAMN33200713, SAMN33200714; Einreichung: SUB12816063.

Die Paired-End-Sequenzierung wurde unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern, die zu den Adaptern des Nextera™-DNA-Bibliotheksvorbereitungskits (Illumina®) komplementär waren, im MR DNA Lab, Shallowater, Texas, USA (http://www.mrdnalab.com/) durchgeführt. Um metagenomische Lesevorgänge von geringer Qualität zu entfernen, wurden die Lesevorgänge mit der Sickle-Software (Version 1.33)54 gekürzt. Anschließend wurden sie auf CDS mit dem taxonomischen Klassifikator Kaiju (Version 1.7.3) taxonomisch klassifiziert55. Als Referenzdatenbank wurden die nichtredundanten Proteinsequenzen des National Center for Biotechnology Information (NCBI) (abgerufen am 25. Juni 2021, enthaltend Proteinsequenzen von Bakterien, Archaeen und Viren) verwendet. Rohdaten der Konsortialprobe wurden im NCBI Sequence Read Archive unter der Zugangsnummer SRR12323727 hinterlegt. Die Carbonactinospora thermoautotrophica MAG-Contigs wurden im NCBI unter dem WGS-Stammdatensatz PQID00000000.1 und Biosample SAMN07787832 hinterlegt.

Die zu rrs-Sequenzen (16 S rRNA-Gen) gehörenden Reads wurden von allen metagenomischen Contigs unter Verwendung der ribosomalen Prädiktorsoftware Barrnap (https://github.com/tseemann/barrnap) erhalten. Um die Phylogenie der gefilterten rrs-Sequenzen zu rekonstruieren, verwendeten wir das Seq Match-Tool aus der Datenbank des Ribosomal Database Project (rrs – nur Sequenzen von >1200 bp, die von kultivierbaren Mikroorganismen stammen). Die fünf ähnlichsten Übereinstimmungen wurden für jedes Contig und Gen ausgewählt und mithilfe der Software MUltiple Sequence Compare by Log-Expectation (Version 3.8.31) abgeglichen. Die phylogene Rekonstruktion wurde mit MEGA-756 unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Methode und des Tamura-Nei-Distanzmodells57 mit 1000 Bootstrap-Replikationen durchgeführt.

Metagenomische Sequenzierungsablesungen wurden mit der SPAdes-Software (Version 3.8.0) zusammengestellt58. Die zu jedem Konsortiumsmitglied gehörenden Contigs wurden mithilfe des CAR-Contig-Assembly-Tools59 mit vollständigen Referenzgenomen aus der NCBI-Datenbank gruppiert, um die MAGs zu erhalten. Die Software BLAST Ring Image Generator (BRIG) (Version 0.95-dev.0004)60 wurde verwendet, um zirkuläre Vergleiche zwischen den vom Konsortium erhaltenen MAGs und denen aus den NCBI-Referenzgenomen anzuzeigen. Alignments wurden von BRIG unter Verwendung des BLASTN-Programms (Version 2.4.0+) und der verketteten MAG-Contigs (aus der vorliegenden Studie) oder der zuvor isolierten LEMMY0123- und Referenzstammsequenzen (UBT1, H1, DMS18167, DSM20745) und metagenomischen Reads generiert. Zusätzlich wurde die DNAPlotter-Software (Version 17)61 verwendet, um das GC-Inhaltsdiagramm hervorzuheben.

Um potenzielle Gene zu identifizieren, die für Nitrogenasen kodieren, und um die nifH-PCR-Ergebnisse, einschließlich der zuvor beschriebenen klassischen und alternativen Enzyme, zu ergänzen, wurden die mit dem Stickstoffstoffwechselweg verbundenen Messwerte in der Software MEtaGenome Analyzer 5 (MEGAN5)26 unter Verwendung der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysiert (KEGG) Pathway- und NCBI-Datenbanken als Referenzen.

Überlappende Paired-End-Lesevorgänge wurden mit der Paired-End-reAd-Merger-Software62 zusammengeführt. Zusammengeführte und nicht zusammengeführte Lesevorgänge wurden mithilfe der Bowtie2-Software63 auf MAGs abgebildet, um die Lesevorgänge zu extrahieren, die zu jedem Konsortiumsmitglied gehörten, einschließlich der fehlenden Gene in den Referenzgenomen. Das BlastX-Tool wurde verwendet, um die extrahierten Lesevorgänge mit der NCBI-Nr-Datenbank abzugleichen. Stoffwechselrekonstruktionen für die Konsortiumsmitglieder wurden mithilfe der KEGG Pathway-Datenbank und der MEGAN5-Software26 erstellt. Die Unterschiede in den Stoffwechselwegen, heteromultimeren Enzymen und Transportern wurden hervorgehoben, um die Möglichkeit einer metabolischen Komplementierung zwischen den Mitgliedern des Konsortiums zu bewerten. Die CheckM-Software wurde verwendet, um die Vollständigkeit von MAGs64 zu bewerten; Die Komplementation zwischen den Hauptstoffwechselwegen wurde durch Übermittlung der MAGs und veröffentlichten Daten zur Gesamtgenomsequenzierung (WGS) von Geobacillus LEMMY0123 an das metabolisHMM-Tool65 bewertet.

Die Experimente wurden mit 15N2-markiertem Luftstickstoff (98 % 15N-Atome; Cambridge Isotopes, Tewksbury, MA, USA) durchgeführt. Um die Stickstofffixierung zu bewerten, wurden die Konsortiumszellen in 40 ml flüssigem N-FIX-Medium mit oder ohne 1,5 g/L (28 mM) NH4Cl gezüchtet und mit 0,6 % Gellangummi in 100-ml-Kolben verfestigt. H. seropedicae ATCC 35892 und E. coli BL21 wurden als Positiv- bzw. Negativkontrollen in JNFb- und SOC-Medien1 verwendet. Für die Übertragung von Konsortialzellen wurde typischerweise eine Gasatmosphäre mit Zusatz von 10 oder 30 ml 15N2 verwendet. Für H. seropedicae und E. coli wurden 10 ml 15N2 + 2 % O2 hinzugefügt. Die Proben wurden 5 bzw. 14 Tage lang bei 55 °C (CNF) bzw. 30 °C (H. seropedicae und E. coli) inkubiert. Nach der Inkubation wurde jegliches vorhandenes Wachstum von den Fläschchen abgekratzt und mit PBS gewaschen. Die gewaschenen Proben wurden 24 Stunden lang bei 60 °C getrocknet. Als nächstes wurde eine Digitalwaage M-220D von Denver Instruments verwendet, um Proben mit einem Gewicht von 0,5–2 mg zu erhalten; Anschließend wurden sie in Kapseln gegeben, in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen eingesetzt und mit Streifenkappen verschlossen. Das 15N/14N-Isotopenverhältnis wurde mittels IRMS (University of California Davis, Stable Isotope Facility, Davis, CA, USA) bestimmt.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften aller Bodenproben wurden dreifach bestimmt. Die Bakterienkulturen wurden in mehreren Flaschen zu mehreren Zeitpunkten repliziert, und mindestens drei Replikate wurden während der Dauer des Experiments am Leben gehalten. Auch die Stabilität des Konsortiums wurde über drei Jahre hinweg überwacht. Kontrollbodenproben und nicht inokulierte Kulturmedien zeigten während derselben Inkubationsdauer kein mikrobielles Wachstum. Zusammengeführte und nicht zusammengeführte Lesevorgänge wurden mithilfe der Bowtie2-Software63 auf MAGs abgebildet, und BlastX wurde verwendet, um die extrahierten Lesevorgänge mit der NCBI-Nr.-Datenbank abzugleichen. Stoffwechselrekonstruktionen wurden mit der KEGG Pathway-Datenbank und der MEGAN5-Software26 durchgeführt und die Komplementation zwischen den Hauptstoffwechselwegen wurde mit metabolisHMM65 bewertet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar. Auf die Amplikon-Sequenzierung kann unter der DDBJ BioProject-ID PRJNA373874 zugegriffen werden: zusammen mit den Zugangsnummern SAMN33200710, SAMN33200711, SAMN33200712, SAMN33200713, SAMN33200714; Einreichung: SUB12816063. Die Rohdaten der Metagenomsequenzierung wurden im NCBI Sequence Read Archive unter der Zugangsnummer SRR12323727 hinterlegt. Die Carbonactinospora thermoautotrophica MAG-Contigs wurden im NCBI unter dem WGS-Stammdatensatz PQID00000000.1 und Biosample SAMN07787832 hinterlegt. Die Quelldaten, die den Abb. zugrunde liegen. 2c und 5 werden jeweils als Zusatzdaten 1–2 bereitgestellt. Zusätzliche Informationen und relevante Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Diese Forschung wurde finanziell vom National Council for Research and Development (CNPq), dem National Council for the Improvement of Higher Education (CAPES) und einem KAUST Baseline Grant (an Prof. AS Rosado) (BAS/1/1096-01) unterstützt -01). Wir danken Edir Martins Ferreira und Tahira Jamil für ihre hervorragende technische Unterstützung und Prof. E. Zonta für die Bodenanalyse. Wir möchten uns an Professor Ulysses Lins erinnern, der leider nicht mehr unter uns ist und dem wir viel mehr als nur Worte zu verdanken haben.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yuri Pinheiro, Fabio Faria da Mota.

Institut für Mikrobiologie, Bundesuniversität Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasilien

Yuri Pinheiro & Ulysses Lins

Labor für Computer- und Systembiologie, Oswaldo Cruz Institut, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasilien

Fabio Faria da Mota

Red Sea Research Center (RSRC), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), Thuwal, 23955-6900, Saudi-Arabien

Raquel S. Peixoto & Alexandre Soares Rosado

Computational Bioscience Research Center (CBRC), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), Thuwal, 23955-6900, Saudi-Arabien

Raquel S. Peixoto & Alexandre Soares Rosado

Mikrobielle Ökologie, Universität Groningen, Groningen, Niederlande

Jan Dirk van Elsas

Ministerium für Land-, Luft- und Wasserressourcen, University of California Davis, Davis, CA, USA

Jorge L. Mazza Rodrigues

Biowissenschaftliches Programm, Abteilung für Bio- und Umweltwissenschaften und Ingenieurwesen (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), Thuwal, Saudi-Arabien

Alexandre Soares Rosado

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ASR konzipierte und gestaltete die Studie; YP, UL und FM führten die Experimente durch; YP, FM, RSP, JDV, JLMR und ASR analysierten die Daten; Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und trugen zur Manuskripterstellung bei. ASR und JLMR stellten finanzielle Unterstützung bereit. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Alexandre Soares Rosado.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Thulani Makhalanyane, Veronique van den Berghe und George Inglis. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Pinheiro, Y., Faria da Mota, F., Peixoto, RS et al. Ein thermophiles chemolithoautotrophes Bakterienkonsortium deutet auf eine gegenseitige Beziehung zwischen Bakterien in extrem oligotrophen Umgebungen hin. Commun Biol 6, 230 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04617-4

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Eingegangen: 16. Juli 2022

Angenommen: 21. Februar 2023

Veröffentlicht: 01. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04617-4

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